די אַנטהעלמינטישע מעדיצין N,N-דיעטיל-m-טאָלואַמיד (דיט) איז געמאלדן געוואָרן צו אינהיביטירן AChE (אַצעטילטשאָלינעסטעראַזע) און האט פּאָטענציעל קאַרסינאָגענע אייגנשאַפטן רעכט צו איבערגעטריבענער וואַסקולאַריזאַציע. אין דעם פּאַפּיר, ווייַזן מיר אַז DEET ספּעציפֿיש סטימולירט ענדאָטעליאַל סעלז וואָס העכערן אַנדזשיאָגענעסיס, דערמיט ינקריסינג טומאָר וווּקס. DEET אַקטיוויזירט צעלולאַרע פּראַסעסאַז וואָס פירן צו אַנדזשיאָגענעסיס, אַרייַנגערעכנט פּראָוליפעריישאַן, מיגראַציע און אַדכיזשאַן. דאָס איז פֿאַרבונדן מיט געוואקסן NO פּראָדוקציע און VEGF אויסדרוק אין ענדאָטעליאַל סעלז. שטיל מאַכן M3 אָדער ניצן פאַרמאַקאַלאַדזשיקאַל M3 ינכיבאַטאָרס האט אָפּגעשטעלט אַלע די יפעקס, סאַגדזשעסטיד אַז DEET-ינדוסט אַנדזשיאָגענעסיס איז M3-סענסיטיוו. עקספּערימענטן אַרייַנגערעכנט קאַלסיום סיגנאַלינג אין ענדאָטעליאַל און HEK סעלז אָוווערעקספּרעסינג M3 רעסעפּטאָרן, ווי געזונט ווי ביינדינג און דאָקינג שטודיעס, ווייַזן אַז DEET אַקץ ווי אַ אַלאָסטעריק מאָדולאַטאָר פון M3 רעסעפּטאָרן. דערצו, DEET אינהיביטירט AChE, דערמיט ינקריסינג די ביאָאַוויילאַביליטי פון אַצעטילטשאָלין און זייַן ביינדינג צו M3 רעסעפּטאָרן, און ענכאַנסינג פּראָאַנגיאָגעניק יפעקס דורך אַלאָסטעריק רעגולאַציע.
פּרימערי ECs זענען אפגעזונדערט געוואָרן פֿון דער אַאָרטאַ פֿון שווייצער מײַז. די עקסטראַקציע מעטאָדע איז אַדאַפּטירט געוואָרן פֿון דעם קאָבײַאַשי פּראָטאָקאָל 26. מויזישע ECs זענען קאָלטיווירט געוואָרן אין EBM-2 מעדיום סופּלעמענטירט מיט 5% היץ-אינאַקטיוויירטע FBS ביזן פֿערטן דורכגאַנג.
דער עפעקט פון צוויי קאנצענטראציעס פון DEET אויף דער פארשפרייטונג פון HUVEC, U87MG, אדער BF16F10 איז אנאליזירט געווארן מיטן CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). בקיצור, 5.103 צעלן פער ברונעם זענען געזייט געווארן אין א 96-ברוננעם טעלער, ערלויבט צו בינדן זיך איבערנאכט, און דערנאך באהאנדלט מיט DEET פאר 24 שעה. נאכדעם וואס מען נעמט ארויס דעם וואוקס מעדיום, לייגט צו א פארב-בינדונג לייזונג צו יעדן ברונעם פון דער מיקרא-טעלער און אינקובירט די צעלן ביי 37 °C פאר 30 מינוט. פלואָרעסענס לעוועלס זענען באשטימט געווארן מיטן נוצן א Mithras LB940 מולטימאדע מיקרא-טעלער לייענער (Berthold Technologies, Bad Wildbad, דייטשלאנד) אויסגעשטאט מיט 485 נ"מ עקסייטאציע פילטערס און 530 נ"מ עמיסיע פילטערס.
HUVEC זענען געזייט געוואָרן אין 96-וועלל פּלאַטעס מיט אַ געדיכטקייט פון 104 צעלן פּער וועלל. צעלן זענען באַהאַנדלט געוואָרן מיט DEET פֿאַר 24 שעה. צעל לעבנספֿעיִקייט איז געשאַצט געוואָרן מיט אַ קאָלאָרימעטרישן MTT אַסיי (Sigma-Aldrich, M5655). אָפּטישע געדיכטקייט ווערטן זענען באַקומען געוואָרן אויף אַ מולטימאָד מיקראָפּלאַטע לייענער (Mithras LB940) מיט אַ כוואַליע לענג פון 570 נם.
די ווירקונגען פון DEET זענען שטודירט געוואָרן מיט אין וויטראָ אַנדזשיאָגענעסיס אַסייז. באַהאַנדלונג מיט 10-8 M אָדער 10-5 M DEET האָט פֿאַרגרעסערט די פֿאָרמאַציע פֿון קאַפּילאַר לענג אין HUVECs (פֿיג. 1a, b, ווײַסע באַרס). פֿאַרגליכן מיט דער קאָנטראָל גרופּע, באַהאַנדלונג מיט DEET קאָנצענטראַציעס פֿון 10-14 ביז 10-5 M האָט געוויזן אַז די קאַפּילאַר לענג האָט דערגרייכט אַ פּלאַטאָ בײַ 10-8 M DEET (צוגאב פֿיג. S2). קיין באַדײַטנדיקער אונטערשייד איז נישט געפֿונען געוואָרן אין דעם אין וויטראָ פּראָאַנגיאָגעניקן ווירקונג פֿון HUVECs באַהאַנדלט מיט DEET אין דער קאָנצענטראַציע קייט פֿון 10-8 M און 10-5 M.
כדי צו באַשטימען דעם ווירקונג פון DEET אויף נעאָוואַסקולאַריזאַציע, האָבן מיר דורכגעפירט אין וויוואָ נעאָוואַסקולאַריזאַציע שטודיעס. נאָך 14 טעג, האָבן מײַז וואָס זענען אינדזשעקטירט געוואָרן מיט ענדאָטעליאַלע צעלן פאַר-קולטורירט מיט 10-8 M אָדער 10-5 M DEET געוויזן אַ באַדײַטנדיקע פאַרגרעסערונג אין העמאָגלאָבין אינהאַלט (פיגור 1c, ווײַסע באַרס).
דערצו, DEET-אינדוצירטע נעאָוואַסקולאַריזאַציע איז געוואָרן שטודירט אין U87MG קסענאָגראַפט-טראָגנדיקע מײַז וואָס זענען טעגלעך (ip) אינדזשעקטירט געוואָרן מיט DEET אין אַ דאָזע באַקאַנט צו אינדוצירן פּלאַזמע קאָנצענטראַציעס פון 10-5 M, וואָס איז נאָרמאַל אין אויסגעשטעלטע מענטשן. אין 23. דעטעקטאַבאַל טומאָרס (ד"ה טומאָרס >100 mm3) זענען באמערקט געוואָרן 14 טעג נאָך אינדזשעקשאַן פון U87MG צעלן אין מײַז. ביי טאָג 28, טומאָר וווּקס איז געווען באַדייטנד ענכאַנסט אין DEET-באַהאַנדלטע מײַז קאַמפּערד מיט קאָנטראָל מײַז (פיגור 1ד, קוואַדראַטן). דערצו, CD31 סטיינינג פון טומאָרס האט געוויזן אַז DEET באַדייטנד געוואקסן קאַפּילאַר שטח אָבער נישט מיקראָוועססעל געדיכטקייט. (פיגור 1e-g).
כדי צו באַשטימען די ראָלע פֿון מוסקאַרינישע רעצעפּטאָרן אין DETA-אינדוצירטער פּראָליפֿעראַציע, איז גענוצט געוואָרן 10-8 M אָדער 10-5 M DETA אין דער אנוועזנהייט פֿון pFHHSiD (10-7 M, אַ סעלעקטיווער M3 רעצעפּטאָר אַנטאַגאָניסט). באַהאַנדלונג פֿון HUVEC. pFHHSiD האָט גאָר בלאָקירט די פּראָליפֿעראַטיווע אייגנשאַפֿטן פֿון DETA אין אַלע קאָנצענטראַציעס (טאַבעלע 1).
אונטער די באדינגונגען, האבן מיר אויך אויסגעפארשט צי DEET וואלט פארגרעסערט קאפילארע לענג אין HUVEC צעלן. ענליך, האט pFHHSiD באדייטנד פארמיטן DEET-אינדוצירטע קאפילארע לענג (פיגור 1א, ב, גרויע בארס). ווייטער, ענליכע עקספערימענטן זענען דורכגעפירט געווארן מיט M3 siRNA. כאטש די קאנטראל siRNA איז נישט געווען עפעקטיוו אין פארבעסערן קאפילארע פארמאציע, האט שטילמאכן דעם M3 מוסקארינישן רעצעפטאר אפגעשאפן די מעגלעכקייט פון DEET צו פארגרעסערן קאפילארע לענג (פיגור 1א, ב, שווארצע בארס).
דערצו, ביידע 10-8 M אדער 10-5 M DEET-אינדוצירטע וואַסקולאַריזאַציע אין וויטראָ און נעאָוואַסקולאַריזאַציע אין וויוואָ זענען גאָר בלאָקירט געוואָרן דורך pFHHSiD (פיגור 1c, d, קרייזן). די רעזולטאַטן ווײַזן אַז DEET פּראָמאָטירט אַנגיאָגענעסיס דורך אַ פּאַטוויי סענסיטיוו צו סעלעקטיווע M3 רעצעפּטאָר אַנטאַגאָניסטן אדער M3 siRNA.
AChE איז די מאָלעקולאַרע ציל פון DEET. מעדיקאַמענטן ווי דאָנעפּעזיל, וואָס אַקטירן ווי AChE אינהיביטאָרן, קענען סטימולירן EC אַנגיאָגענעסיס אין וויטראָ און אין מויז הינטערגליד ישעמיאַ מאָדעלס14. מיר האָבן טעסטעד די ווירקונג פון צוויי קאָנצענטראַציעס פון DEET אויף AChE ענזיים טעטיקייט אין HUVEC. נידעריקע (10-8 M) און הויכע (10-5 M) קאָנצענטראַציעס פון DEET האָבן פאַרמינערט ענדאָטעליאַל AChE טעטיקייט קאַמפּערד צו קאָנטראָל באדינגונגען (פיגור 2).
ביידע קאנצענטראציעס פון DEET (10-8 M און 10-5 M) האבן פארקלענערט אַסעטילטשאָלינעסטעראַזע טעטיקייט אויף HUVEC. BW284c51 (10-5 M) איז גענוצט געוואָרן ווי אַ קאָנטראָל פֿאַר אַסעטילטשאָלינעסטעראַזע אינהיביטאָרן. רעזולטאַטן ווערן אויסגעדריקט ווי אַ פּראָצענט פון AChE טעטיקייט אויף HUVEC באַהאַנדלט מיט די צוויי קאנצענטראציעס פון DEET קאַמפּערד צו וועהיקלע-באַהאַנדלטע צעלן. ווערטן ווערן אויסגעדריקט ווי דורכשניט ± SEM פון זעקס אומאָפּהענגיקע עקספּערימענטן. *p < 0.05 קאַמפּערד צו קאָנטראָל (Kruskal-Wallis און Dunn קייפל פאַרגלייַך טעסט).
ניטריק אקסייד (NO) איז פארמישט אין דעם אנגיאגענישן פראצעס 33, דעריבער, איז NO פראדוקציע אין DEET-סטימולירטע HUVECs געווארן שטודירט. DEET-באהאנדלטע ענדאטעליאַל NO פראדוקציע איז געוואקסן קאמפערד צו קאנטראל צעלן, אבער האט דערגרייכט באדייטונג נאר ביי א דאזע פון 10-8 M (פיגור 3c). צו באשטימען די מאלעקולארע ענדערונגען וואס קאנטראלירן DEET-אינדוצירטע NO פראדוקציע, זענען eNOS אויסדרוק און אקטיוואציע אנאליזירט געווארן דורך וועסטערן בלאטטינג. כאטש DEET באהאנדלונג האט נישט געטוישט eNOS אויסדרוק, האט עס באדייטנד געוואקסן eNOS פאספארילאציע ביי זיין אקטיווירנדיקן ארט (Ser-1177) בשעת עס האט פארקלענערט זיין אינהיביטארי ארט (Thr-495) קאמפערד צו נישט-באהאנדלטע צעלן אין eNOS פאספארילאציע (פיגור 3d). ווייטער, איז די פראפארציע פון פאספארילירט eNOS ביי די אקטיווירנדיקן ארט און אינהיביטארי ארט אויסגערעכנט געווארן נאך נארמאליזירן די צאל פאספארילירט eNOS צו די גאנצע צאל ענזיים. די פראפארציע איז באדייטנד געוואקסן אין HUVECs באהאנדלט מיט יעדער קאנצענטראציע פון DEET קאמפערד צו נישט-באהאנדלטע צעלן (פיגור 3d).
צום סוף, די אויסדרוק פון VEGF, איינער פון די הויפּט פּראָאַנגיאָגענע פאַקטאָרן, איז אַנאַליזירט געוואָרן דורך וועסטערן בלאָטינג. DEET האט באַדייטנד געוואקסן VEGF אויסדרוק, בשעת pFHHSiD האט גאָר בלאָקירט דעם אויסדרוק.
זינט די ווירקונגען פון DEET זענען סענסיטיוו צו ביידע פאַרמאַקאָלאָגישע בלאָקאַדע און דאַונרעגולאַציע פון M3 רעצעפּטאָרן, האָבן מיר געטעסט די היפּאָטעזע אַז DEET קען פֿאַרבעסערן קאַלסיום סיגנאַלינג. איבעראשנד, DEET האט נישט געקענט פאַרגרעסערן ציטאָפּלאַזמיש קאַלסיום אין HUVEC (דאַטן נישט געוויזן) און HEK/M3 (פיגור 4a, b) פֿאַר ביידע קאָנצענטראַציעס געניצט.
פּאָסט צייט: 30 דעצעמבער 2024