קוואַנטיטאַטיווע גיבבערעלין ביאָסענסאָר אַנטפּלעקט די ראָלע פון ​​גיבבערעלינס אין אינטערנאָוד ספּעסיפֿיקאַציע אין די שפּראָץ אַפּיקאַל מעריסטעם

שפּראָץ אַפּיקאַל מעריסטעם (SAM) וווּקס איז קריטיש פֿאַר שטאַם אַרכיטעקטור. פלאַנצן האָרמאָנעןגיבבערעלינס(GAs) שפּילן שליסל ראָלעס אין קאָאָרדינירן פלאַנצן וווּקס, אָבער זייער ראָלע אין די SAM בלייבט שוואַך פארשטאנען. דאָ, מיר האָבן דעוועלאָפּעד אַ ראַטיאָמעטרישע ביאָסענסאָר פון GA סיגנאַלינג דורך אינזשענירן די DELLA פּראָטעין צו סאַפּרעס זיין יקערדיק רעגולאַטאָרי פונקציע אין די GA טראַנסקריפּשאַנאַל ענטפער בשעת פּראַזערווינג זיין דעגראַדיישאַן אויף GA דערקענונג. מיר ווייַזן אַז דעם דעגראַדיישאַן-באזירט ביאָסענסאָר אַקיעראַטלי רעקאָרדס ענדערונגען אין GA לעוועלס און צעלולאַרע סענסינג בעשאַס אַנטוויקלונג. מיר האָבן געניצט דעם ביאָסענסאָר צו מאַפּ GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין די SAM. מיר ווייַזן אַז הויך GA סיגנאַלז זענען פאָרשטעלן פּרידאַמאַנאַנטלי אין סעלז ליגן צווישן אָרגאַן פּרימאָרדיאַ, וואָס זענען פּריקערסערז צו ינטערנאָוד סעלז. ניצן געווינען- און אָנווער-פון-פונקציע אַפּראָוטשיז, מיר ווייטער ווייַזן אַז GA רעגולירט די אָריענטירונג פון די צעל דיוויזשאַן פלאַך, ינקעראַדזשינג די קאַנאָניקאַל צעלולאַרע אָרגאַניזאַציע פון ​​ינטערנאָדעס, דערמיט פּראַמאָוטינג ינטערנאָוד ספּעסיפיקאַטיאָן אין די SAM.
דער שפּראָץ אַפּיקאַל מעריסטעם (SAM), וואָס געפינט זיך ביים שפּראָץ שפּיץ, אנטהאלט א נישע פון ​​שטאַם צעלן וועמענס טעטיקייט דזשענערירט זייטיקע אָרגאַנען און שטאַם נאָודז אין א מאָדולאַר און איטעראַטיוו שטייגער איבערן גאַנצן לעבן פון דער פלאַנץ. יעדער פון די איבערחזרנדיקע איינהייטן, אדער פלאַנץ נאָודז, אנטהאלט אינטערנאָדן און זייטיקע אָרגאַנען ביי די נאָודז, און אַקסיללאַרי מעריסטעמס אין די בלאַט אַקסלען1. דער וואוקס און אָרגאַניזאַציע פון ​​פלאַנץ נאָודז ענדערט זיך בעת דער אַנטוויקלונג. אין אַראַבידאָפּסיס, ווערט אינטערנאָדאַל וואוקס אונטערדריקט בעת דער וועגעטאַטיווער בינע, און אַקסיללאַרי מעריסטעמס בלייבן שלאָפנדיק אין די אַקסלען פון ראָזעטע בלעטער. בעת דעם איבערגאַנג צו דער בלום פאַזע, ווערט דער SAM דער ינפלאָרעססענס מעריסטעם, דזשענערירנדיק פארלענגערטע אינטערנאָדן און אַקסיללאַרי קנאָספּן, צווייַגלעך אין די אַקסלען פון קאָלין בלעטער, און שפּעטער, בלעטערלאָזע בלומען2. כאָטש מיר האָבן געמאַכט באַדייטנדיקע פּראָגרעס אין פארשטיין די מעקאַניזמען וואָס קאָנטראָלירן די איניציאַציע פון ​​בלעטער, בלומען און צווייגן, איז רעלאַטיוו ווייניק באַקאַנט וועגן ווי אינטערנאָדן אויפשטיין.
פֿאַרשטיין די ספּאַציאָטעמפּאָראַל פאַרשפּרייטונג פון GAs וועט העלפֿן בעסער פֿאַרשטיין די פֿונקציעס פון די האָרמאָנעס אין פֿאַרשידענע געוועבן און אין פֿאַרשידענע אַנטוויקלונג סטאַגעס. וויזשוואַליזאַציע פון ​​​​די דעגראַדאַציע פון ​​​​RGA-GFP פוסיאָן אויסגעדריקט אונטער דער אַקציע פון ​​​​זיין אייגענעם פּראָמאָטער גיט וויכטיק אינפֿאָרמאַציע וועגן די רעגולאַציע פון ​​​​גאַנץ GA לעוועלס אין וואָרצלען 15,16. אָבער, RGA אויסדרוק וועריז אַריבער געוועבן 17 און איז רעגולירט דורך GA 18. אַזוי, דיפערענטשאַל אויסדרוק פון די RGA פּראָמאָטער קען רעזולטאַט אין די פלאָרעסענס מוסטער באמערקט מיט RGA-GFP און אַזוי דעם אופֿן איז נישט קוואַנטיטאַטיוו. לעצטנס, ביאָאַקטיוו פלאָרעססעין (Fl)-מאַרקעד GA 19,20 גילוי די אַקיומיאַליישאַן פון GA אין די וואָרצל ענדאָקאָרטעקס און די רעגולאַציע פון ​​​​זיין צעלולאַרע לעוועלס דורך GA טראַנספּאָרט. לעצטנס, די GA FRET סענסאָר nlsGPS1 געוויזן אַז GA לעוועלס קאָראַלירן מיט צעל ילאָנגגיישאַן אין וואָרצלען, פילאַמענץ, און טונקל-געוואַקסן היפּאָקאָטילס 21. אָבער, ווי מיר האָבן געזען, GA קאַנסאַנטריישאַן איז נישט דער בלויז פּאַראַמעטער קאַנטראָולד GA סיגנאַלינג טעטיקייט, ווייַל עס דעפּענדס אויף קאָמפּלעקס סענסינג פּראַסעסאַז. דאָ, בויענדיק אויף אונדזער פארשטאנד פון די DELLA און GA סיגנאַלינג פּאַטווייז, באַריכטן מיר די אַנטוויקלונג און כאַראַקטעריזאַציע פון ​​אַ דעגראַדאַציע-באַזירט ראַטיאָמעטרישער ביאָסענסאָר פֿאַר GA סיגנאַלינג. צו אַנטוויקלען דעם קוואַנטיטאַטיוון ביאָסענסאָר, האָבן מיר גענוצט אַ מוטאַנט GA-סענסיטיווע RGA וואָס איז געווען פיוזד צו אַ פלורעסענט פּראָטעין און יוביקוויטאַסלי אויסגעדריקט אין געוועבן, ווי אויך אַ GA-נישט-סענסיטיווע פלורעסענט פּראָטעין. מיר ווייַזן אַז די מוטאַנט RGA פּראָטעין פיוזשאַנז טאָן ניט ינטערפיר מיט ענדאָגענאָוס GA סיגנאַלינג ווען יוביקוויטאַסלי אויסגעדריקט, און אַז דעם ביאָסענסאָר קענען קוואַנטיפיצירן סיגנאַלינג טעטיקייט ריזאַלטינג פון ביידע GA אַרייַנשרייַב און GA סיגנאַל פּראַסעסינג דורך די סענסינג אַפּאַראַט מיט הויך ספּאַטיאָטעמפּאָראַל האַכלאָטע. מיר האָבן גענוצט דעם ביאָסענסאָר צו מאַפּ די ספּאַטיאָטעמפּאָראַל פאַרשפּרייטונג פון GA סיגנאַלינג טעטיקייט און קוואַנטיפיצירן ווי GA רעגולירט צעלולאַר נאַטור אין די SAM עפּאַדערמיס. מיר ווייַזן אַז GA רעגולירט די אָריענטירונג פון די דיוויזשאַן פלאַך פון SAM סעלז ליגן צווישן אָרגאַן פּרימאָרדיאַ, דערמיט דעפינירן די קאַנאָניקאַל צעלולאַר אָרגאַניזאַציע פון ​​די ינטערנאָדע.
צום סוף, האבן מיר געפרעגט צי qmRGA קען באריכטן ענדערונגען אין ענדאָגענע GA לעוועלס ניצנדיק וואַקסנדיקע היפּאָקאָטילס. מיר האבן פריער געוויזן אז נייטרייט סטימולירט וואוקס דורך פארגרעסערן GA סינטעז און, אין קער, DELLA34 דעגראַדאַציע. דעריבער, האבן מיר באמערקט אז היפּאָקאָטיל לענג אין pUBQ10::qmRGA זוימען וואס זענען געוואקסן אונטער א שעפעדיקע נייטרייט צושטעל (10 mM NO3−) איז געווען באדייטנד לענגער ווי אין זוימען וואס זענען געוואקסן אונטער נייטרייט-דעפיציענט באדינגונגען (צוגאב בילד 6a). אין איינקלאנג מיט דער וואוקס רעאקציע, זענען GA סיגנאַלן געווען העכער אין היפּאָקאָטילס פון זוימען וואס זענען געוואקסן אונטער 10 mM NO3− באדינגונגען ווי אין זוימען וואס זענען געוואקסן אָן נייטרייט (צוגאב בילד 6b, c). אזוי, qmRGA ערמעגליכט אויך מאָניטאָרינג פון ענדערונגען אין GA סיגנאַלינג אינדוצירט דורך ענדאָגענע ענדערונגען אין GA קאָנצענטראַציע.
כדי צו פֿאַרשטיין צי די GA סיגנאַלינג אַקטיוויטעט דעטעקטירט דורך qmRGA דעפּענדס אויף GA קאָנצענטראַציע און GA וואָרנעמונג, ווי געריכט באַזירט אויף די סענסאָר פּלאַן, מיר אַנאַליזירט די אויסדרוק פון די דרייַ GID1 רעסעפּטאָרן אין וועגעטאַטיווע און רעפּראָדוקטיווע געוועבן. אין זוימען, די GID1-GUS רעפּאָרטער ליניע געוויזן אַז GID1a און c זענען העכסט אויסגעדריקט אין קאָטילעדאָנס (פיגור 3a-c). אין דערצו, אַלע דרייַ רעסעפּטאָרן זענען אויסגעדריקט אין בלעטער, לאַטעראַל וואָרצל פּרימאָרדיאַ, וואָרצל שפּיץ (חוץ פֿאַר די וואָרצל קאַפּ פון GID1b), און די וואַסקולאַר סיסטעם (פיגור 3a-c). אין די ינפלאָרעססענסע SAM, מיר דעטעקטעד GUS סיגנאַלן בלויז פֿאַר GID1b און 1c (צוגאב פיגור 7a-c). אין סיטו כייברידאַזיישאַן באשטעטיקט די אויסדרוק פּאַטערנז און ווייטער דעמאַנסטרייטיד אַז GID1c איז געווען יוואַנלי אויסגעדריקט אין נידעריק לעוועלס אין די SAM, כוועראַז GID1b געוויזן העכער אויסדרוק אין די פּעריפעריע פון ​​די SAM (צוגאב פיגור 7d-l). די pGID1b::2xmTQ2-GID1b טראַנסליישאַנאַל פיוזשאַן האט אויך אַנטפּלעקט אַ גראַדעד קייט פון GID1b אויסדרוק, פון נידעריק אָדער קיין אויסדרוק אין דעם צענטער פון די SAM צו הויך אויסדרוק ביי די אָרגאַן גרענעצן (צוגאב בילד 7m). אזוי, GID1 רעצעפּטאָרן זענען נישט גלייַך פאַרשפּרייט אַריבער און אין געוועבן. אין סאַבסאַקוואַנט עקספּערימענטן, מיר אויך באמערקט אַז אָוווערעקספּרעססיאָן פון GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) געוואקסן די סענסיטיוויטי פון qmRGA אין היפּאָקאָטילס צו פונדרויסנדיק GA אַפּלאַקיישאַן (פיג. 3d, e). אין קאַנטראַסט, פלאָרעסאַנס געמאסטן דורך qd17mRGA אין די היפּאָקאָטיל איז געווען ניט סענסיטיוו צו GA3 באַהאַנדלונג (פיג. 3f, g). פֿאַר ביידע אַסייז, זוימען זענען באהאנדלט מיט הויך קאַנסאַנטריישאַנז פון GA (100 μM GA3) צו אַססעסס די שנעל נאַטור פון די סענסאָר, ווו די פיייקייַט צו בינדן צו די GID1 רעצעפּטאָר איז געווען ענכאַנסט אָדער פאַרפאַלן. צוזאַמען, באַשטעטיקן די רעזולטאַטן אַז דער qmRGA ביאָסענסאָר דינט אַ קאָמבינירטע פונקציע ווי אַ GA און GA סענסאָר, און פֿאָרשלאָגן אַז די דיפערענציעלע אויסדרוק פון די GID1 רעצעפּטאָר קען באַדייטנד מאָדולירן די עמיסיוויטי פון די סענסאָר.
ביז היינט, בלייבט די פארשפרייטונג פון GA סיגנאלן אין די SAM נישט קלאר. דעריבער, האבן מיר גענוצט qmRGA-אויסדריקנדיקע פלאנצן און די pCLV3::mCherry-NLS סטעם צעל רעפארטער35 צו רעכענען הויך-רעזאלוציע קוואנטיטאטיווע מאפעס פון GA סיגנאלינג אקטיוויטעט, פאקוסירנדיג אויף די L1 שיכט (עפידערמיס; פיג. 4a, b, זעה מעטאדן און צוגאב מעטאדן), ווייל L1 שפילט א שליסל ראלע אין קאנטראלירן SAM וואוקס36. דא, האט pCLV3::mCherry-NLS אויסדרוק געגעבן א פעסטן געאמעטרישן רעפערענץ פונקט פארן אנאליזירן די ספעציאטעמפאראלע פארשפרייטונג פון GA סיגנאלינג אקטיוויטעט37. כאטש GA ווערט באטראכט אלס עסענציעל פאר זייטיקער ארגאן אנטוויקלונג4, האבן מיר באמערקט אז GA סיגנאלן זענען געווען נידעריג אין די פלאראלע פרימארדיום (P) אנפאנגענדיג פון די P3 שטאפל (פיג. 4a, b), משא"כ יונגע P1 און P2 פרימארדיוםס האבן געהאט מיטלמעסיגע אקטיוויטעט ענליך צו יענע אין די צענטראלע ראיאן (פיג. 4a, b). העכערע GA סיגנאַלינג אַקטיוויטעט איז געווען דעטעקטירט ביי די אָרגאַן פּרימאָרדיום גרענעצן, אָנהייבנדיק ביי P1/P2 (ביי די זייטן פון דער גרענעץ) און דערגרייכנדיק דעם שפּיץ ביי P4, ווי אויך אין אַלע צעלן פון דער פּעריפערישער געגנט וואָס געפינט זיך צווישן די פּרימאָרדיאַ (פיגור 4a, b און סאַפּלעמענטאַרי פיגור 8a, b). די העכערע GA סיגנאַלינג אַקטיוויטעט איז באמערקט געוואָרן ניט בלויז אין דער עפּאַדערמיס, נאָר אויך אין די L2 און אויבערשטע L3 שיכטן (סאַפּלעמענטאַרי פיגור 8b). דער מוסטער פון GA סיגנאַלן דעטעקטירט אין די SAM ניצן qmRGA איז אויך געבליבן אַנענדערד איבער צייט (סאַפּלעמענטאַרי פיגור 8c–f, k). כאָטש די qd17mRGA קאָנסטרוקט איז געווען סיסטעמאַטיש דאַונרעגיאַלייטיד אין די SAM פון T3 געוויקסן פון פינף אומאָפּהענגיקע ליניעס וואָס מיר האָבן קעראַקטעריזירט אין דעטאַל, מיר זענען געווען ביכולת צו אַנאַליזירן די פלאָרעסאַנס פּאַטערנז באקומען מיט די pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP קאָנסטרוקט (סאַפּלעמענטאַרי פיגור 8g–j, l). אין דעם קאָנטראָל ליניע, בלויז קליינע ענדערונגען אין די פלאָרעסאַנס פאַרהעלטעניש זענען דעטעקטירט געוואָרן אין די SAM, אָבער אין די SAM צענטער מיר האָבן באמערקט אַ קלאָר און אומגעריכט פאַרקלענערן אין VENUS פֿאַרבונדן מיט TagBFP. דאָס באַשטעטיקט אַז דער סיגנאַלינג מוסטער באמערקט דורך qmRGA שפּיגלט אָפּ GA-אָפּהענגיקע דעגראַדאַציע פון ​​mRGA-VENUS, אָבער אויך דעמאָנסטרירט אַז qmRGA קען איבערשאַצן GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין די מעריסטעם צענטער. אין קיצער, אונדזערע רעזולטאַטן אַנטפּלעקן אַ GA סיגנאַלינג מוסטער וואָס שפּיגלט הויפּטזעכלעך אָפּ די פאַרשפּרייטונג פון פּרימאָרדיאַ. די פאַרשפּרייטונג פון די אינטער-פּרימאָרדיאַל געגנט (IPR) איז רעכט צו דער גראַדועל פאַרלייגן פון הויך GA סיגנאַלינג טעטיקייט צווישן די אַנטוויקלענדיק פּרימאָרדיום און די צענטראַל געגנט, בשעת אין דער זעלביקער צייט GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין די פּרימאָרדיום פאַרמינערט זיך (פיגור 4c, d).
די פאַרשפּרייטונג פון GID1b און GID1c רעצעפּטאָרן (זען אויבן) סאַגדזשעסטיד אַז דיפערענציעלע אויסדרוק פון GA רעצעפּטאָרן העלפּס פאָרעם דעם מוסטער פון GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין די SAM. מיר האָבן זיך געוואונדערט צי דיפערענציעלע אַקיומיאַליישאַן פון GA קען זיין ינוואַלווד. צו ונטערזוכן דעם מעגלעךקייט, מיר געוויינט די nlsGPS1 GA FRET סענסאָר21. געוואקסן אַקטיוויישאַן אָפטקייַט איז געווען דיטעקטיד אין די SAM פון nlsGPS1 באהאנדלט מיט 10 μM GA4+7 פֿאַר 100 מינוט (סאַפּלעמענטאַרי פיג. 9a-e), וואָס ינדיקייץ אַז nlsGPS1 ריאַגז צו ענדערונגען אין GA קאַנסאַנטריישאַן אין די SAM, ווי עס טוט אין וואָרצלען21. ספּאַציאַל פאַרשפּרייטונג פון nlsGPS1 אַקטיוויישאַן אָפטקייַט האט גילוי לעפיערעך נידעריק GA לעוועלס אין די ויסווייניקסט לייַערס פון די SAM, אָבער געוויזן אַז זיי זענען עלעוואַטעד אין די צענטער און ביי די גרענעצן פון די SAM (פיג. 4e און סאַפּלעמענטאַרי פיג. 9a,c). דאָס סאַגדזשעסטיד אַז GA איז אויך פאַרשפּרייט אין די SAM מיט אַ ספּאַציאַל מוסטער פאַרגלייַכלעך צו דעם גילוי דורך qmRGA. אלס א קאמפלעמענטארער צוגאנג, האבן מיר אויך באהאנדלט דעם SAM מיט פלורעסצענט GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) אדער Fl אליין אלס א נעגאטיוון קאנטראל. דער Fl סיגנאל איז געווען פארשפרייט איבערן גאנצן SAM, אריינגערעכנט דעם צענטראלן ראיאן און פרימארדיום, כאטש מיט א נידעריגערן אינטענסיטעט (פיגור 4j און סופּלעמענטארע פיגור 10d). אין קאנטראסט, אלע דריי GA-Fl האבן זיך אנגעזאמלט ספעציפיש אינערהאלב די פרימארדיום גרענעצן און צו פארשידענע גראדן אין די רעשט פון די IPR, מיט GA7-Fl וואס האט זיך אנגעזאמלט אין דעם גרעסטן דאמעין אין די IPR (פיגור 4k און סופּלעמענטארע פיגור 10a,b). קוואנטיפיקאציע פון ​​פלורעסצענץ אינטענסיטעט האט געוויזן אז די IPR צו נישט-IPR אינטענסיטעט פארהעלטעניש איז געווען העכער אין GA-Fl-באהאנדלטן SAM קאמפערד צו Fl-באהאנדלטן SAM (פיגור 4l און סופּלעמענטארע פיגור 10c). צוזאמען, ווייזן די רעזולטאטן אז GA איז פאראן אין העכערע קאנצענטראציעס אין IPR צעלן וואס געפינען זיך דעם נענטסטן צום ארגאן גרענעץ. דאָס סאַגדזשעסטירט אַז דער מוסטער פון SAM GA סיגנאַלינג טעטיקייט רעזולטירט פון ביידע דיפערענציעלע אויסדרוק פון GA רעצעפּטאָרן און דיפערענציעלע אַקיומיאַליישאַן פון GA אין IPR צעלן לעבן אָרגאַן גרענעצן. אַזוי, אונדזער אַנאַליז האט אַנטפּלעקט אַן אומגעריכטע ספּאַציאָטעמפּאָראַל מוסטער פון GA סיגנאַלינג, מיט נידעריקער טעטיקייט אין די צענטער און פּרימאָרדיום פון די SAM און העכער טעטיקייט אין די IPR אין די פּעריפעראַל געגנט.
כדי צו פֿאַרשטיין די ראָלע פֿון דיפֿערענציעלער GA סיגנאַלינג אַקטיוויטעט אין די SAM, האָבן מיר אַנאַליזירט די קאָרעלאַציע צווישן GA סיגנאַלינג אַקטיוויטעט, צעל יקספּאַנשאַן, און צעל טיילונג ניצן רעאַל-צייט צייט-לאַפּס ימאַגינג פֿון די SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. געגעבן די ראָלע פֿון GA אין וווּקס רעגולאַציע, איז אַ positive קאָרעלאַציע מיט צעל יקספּאַנשאַן פּאַראַמעטערס געווען דערוואַרט. דעריבער, האָבן מיר ערשט פֿאַרגליכן GA סיגנאַלינג אַקטיוויטעט מאַפּס מיט מאַפּס פֿון צעל ייבערפלאַך וווּקס קורס (ווי אַ פּראַקסי פֿאַר די שטאַרקייט פֿון צעל יקספּאַנשאַן פֿאַר אַ געגעבענע צעל און פֿאַר טאָכטער סעלז ביי טיילונג) און מיט מאַפּס פֿון וווּקס אַניזאָטראָפּי, וואָס מעסט די ריכטונג פֿון צעל יקספּאַנשאַן (אויך געניצט דאָ פֿאַר אַ געגעבענע צעל און פֿאַר טאָכטער סעלז ביי טיילונג; בילד 5a,b, זען מעטאָדן און סאַפּלעמענטאַרי מעטאָדן). אונדזער מאַפּס פֿון SAM צעל ייבערפלאַך וווּקס קורס זענען קאָנסיסטענט מיט פֿריִערדיקע אָבסערוואַציעס38,39, מיט מינימאַל וווּקס ראַטעס ביי דער גרענעץ און מאַקסימאַל וווּקס ראַטעס אין דעוועלאָפּינג בלומען (בילד 5a). פּרינסיפּאַל קאָמפּאָנענט אַנאַליסיס (PCA) האט געוויזן אַז GA סיגנאַלינג אַקטיוויטעט איז געווען נעגאַטיוו קאָרעלירט מיט צעל ייבערפלאַך וווּקס אינטענסיטי (בילד 5c). מיר האָבן אויך געוויזן אַז די הויפּט אַקסן פון וואַריאַציע, אַרייַנגערעכנט GA סיגנאַלינג אינפוט און וווּקס אינטענסיטי, זענען געווען אָרטאָגאָנאַל צו דער ריכטונג באַשטימט דורך הויך CLV3 אויסדרוק, באַשטעטיקנדיק די אויסשליסונג פון סעלז פון די SAM צענטער אין די רוען אַנאַליזעס. ספּירמאַן קאָרעלאַציע אַנאַליז באַשטעטיקט די PCA רעזולטאַטן (פיגור 5ד), ווייַזנדיק אַז העכער GA סיגנאַלז אין די IPR האָבן נישט רעזולטאַט אין העכער צעל יקספּאַנשאַן. אָבער, קאָרעלאַציע אַנאַליז האט געוויזן אַ קליין positive קאָרעלאַציע צווישן GA סיגנאַלינג טעטיקייט און וווּקס אַניזאָטראָפּי (פיגור 5ק, ד), סאַגדזשעסטינג אַז העכער GA סיגנאַלינג אין די IPR ינפלוענסיז די ריכטונג פון צעל וווּקס און מעגלעך די שטעלע פון ​​​​די צעל דיוויזשאַן פלאַך.
a, b היץ מאַפּעס פון דורכשניטלעך ייבערפלאַך וווּקס (a) און וווּקס אַניזאָטראָפּי (b) אין SAM דורכשניטלעך איבער זיבן אומאָפּהענגיקע געוויקסן (געניצט ווי פּראַקסיז פֿאַר די שטאַרקייט און ריכטונג פון צעל יקספּאַנשאַן, ריספּעקטיוולי). c PCA אַנאַליסיס אַרייַנגערעכנט די פאלגענדע וועריאַבאַלז: GA סיגנאַל, ייבערפלאַך וווּקס אינטענסיטי, ייבערפלאַך וווּקס אַניזאָטראָפּי, און CLV3 אויסדרוק. PCA קאָמפּאָנענט 1 איז געווען מערסטנס נעגאַטיוו קאָרעלירט מיט ייבערפלאַך וווּקס אינטענסיטי און פּאָזיטיוו קאָרעלירט מיט GA סיגנאַל. PCA קאָמפּאָנענט 2 איז געווען מערסטנס פּאָזיטיוו קאָרעלירט מיט ייבערפלאַך וווּקס אַניזאָטראָפּי און נעגאַטיוו קאָרעלירט מיט CLV3 אויסדרוק. פּראָצענטן רעפּרעזענטירן די וואַריאַציע דערקלערט דורך יעדער קאָמפּאָנענט. d ספּירמאַן קאָרעלאַציע אַנאַליסיס צווישן GA סיגנאַל, ייבערפלאַך וווּקס אינטענסיטי, און ייבערפלאַך וווּקס אַניזאָטראָפּי אין די געוועב וואָג אַחוץ CZ. די נומער אויף די רעכט איז די ספּירמאַן rho ווערט צווישן צוויי וועריאַבאַלז. אַסטעריסקס ווייַזן קאַסעס ווו די קאָרעלאַציע / נעגאַטיוו קאָרעלאַציע איז העכסט באַטייַטיק. e 3D וויזשוואַלאַזיישאַן פון Col-0 SAM L1 סעלז דורך קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּי. נייַע צעל ווענט געשאפן אין די SAM (אָבער נישט די פּרימאָרדיום) בייַ 10 שעה זענען קאָלירט לויט זייער ווינקל ווערטן. די קאליר באַר ווערט געוויזן אין דער אונטערשטער רעכטער ווינקל. די אינסעט ווייזט די קאָרעספּאָנדירנדיקע 3D בילד ביי 0 שעה. דער עקספּערימענט איז געווען איבערגעחזרט צוויי מאָל מיט ענלעכע רעזולטאַטן. f קעסטל פּלאָץ ווייַזן צעל טיילונג ראַטעס אין IPR און ניט-IPR קאָל-0 SAM (n = 10 אומאָפּהענגיקע פלאַנצן). די צענטער ליניע ווייזט די מעדיאַן, און די קעסטל גרענעצן ווייַזן די 25סטע און 75סטע פּערסענטילן. וויסקערז ווייַזן די מינימום און מאַקסימום ווערטן באַשטימט מיט R ווייכווארג. P ווערטן זענען באקומען מיט וועלטש ס צוויי-טיילד t-טעסט. g, h סכעמאַטיש דיאַגראַם ווייַזט (g) ווי צו מעסטן דעם ווינקל פון דער נייַ צעל וואַנט (מאַגענטאַ) מיט רעספּעקט צו די ראַדיאַל ריכטונג פון די צענטער פון די SAM (ווייַס פּונקטירטע ליניע) (נאָר שאַרף ווינקל ווערטן, ד"ה, 0-90°, זענען באַטראַכט), און (h) די סירקומפערענטשאַל/לאַטעראַל און ראַדיאַל ריכטונגען אין די מעריסטעם. i אָפטקייַט כיסטאָגראַפימז פון צעל טיילונג פלאַך אָריענטירונג אַריבער די SAM (טונקל בלוי), IPR (מיטל בלוי), און ניט-IPR (ליכט בלוי), ריספּעקטיוולי. פּ ווערטן זענען באקומען געוואָרן דורך אַ צוויי-זייַטיקן קאָלמאָגאָוו-סמירנאָוו טעסט. דער עקספּערימענט איז געווען איבערגעחזרט צוויי מאָל מיט ענלעכע רעזולטאַטן. דזש פרעקווענץ היסטאָגראַמען פון צעל טיילונג פלאַך אָריענטירונג פון די IPR אַרום P3 (ליכט גרין), P4 (מיטל גרין), און P5 (טונקל גרין), ריספּעקטיוולי. פּ ווערטן זענען באקומען געוואָרן דורך אַ צוויי-זייַטיקן קאָלמאָגאָוו-סמירנאָוו טעסט. דער עקספּערימענט איז געווען איבערגעחזרט צוויי מאָל מיט ענלעכע רעזולטאַטן.
דעריבער, האָבן מיר ווייטער אויסגעפאָרשט די קאָרעלאַציע צווישן GA סיגנאַלינג און צעל טיילונג טעטיקייט דורך אידענטיפיצירן ניי געשאַפענע צעל ווענט בעת דעם פּרוביר (פיגור 5e). דער צוגאַנג האָט אונדז דערלויבט צו מעסטן די אָפטקייט און ריכטונג פון צעל טיילונג. איבעראשנד, האָבן מיר געפונען אַז די אָפטקייט פון צעל טיילונגען אין די IPR און די רעשט פון די SAM (נישט-IPR, פיגור 5f) איז געווען ענלעך, וואָס ווײַזט אַז די אונטערשיידן אין GA סיגנאַלינג צווישן IPR און נישט-IPR צעלן טאָן ניט באַדײַטנדיק ווירקן אויף צעל טיילונג. דאָס, און די positive קאָרעלאַציע צווישן GA סיגנאַלינג און וווּקס אַניזאָטראָפּי, האָט אונדז געפֿירט צו באַטראַכטן צי GA סיגנאַלינג טעטיקייט קען השפּעה האָבן אויף די אָריענטאַציע פון ​​​​די צעל טיילונג פלאַך. מיר האָבן געמאָסטן די אָריענטאַציע פון ​​דער נײַער צעל־וואַנט ווי אַן שאַרפער ווינקל אין באַצוג צו דער ראַדיאַלער אַקס וואָס פֿאַרבינדט דעם מעריסטעם־צענטער און דעם צענטער פֿון דער נײַער צעל־וואַנט (פֿיג. 5e-i) און באַאָבאַכטעט אַ קלאָרע טענדענץ פֿאַר צעלן זיך צו צעטיילן אין ווינקלען נאָענט צו 90° אין באַצוג צו דער ראַדיאַלער אַקס, מיט די העכסטע פֿרעקווענצן באַאָבאַכטעט בײַ 70–80° (23.28%) און 80–90° (22.62%) (פֿיג. 5e,i), וואָס קאָרעספּאָנדירט צו צעל־צעטיילונגען אין דער אַרומקרייזלעכער/טראַנסווערסאַלער ריכטונג (פֿיג. 5h). כּדי צו אויספֿאָרשן דעם בײַטראָג פֿון GA סיגנאַלינג צו דעם צעל־צעטיילונג־פֿאַרהאַלטן, האָבן מיר אַנאַליזירט צעל־צעטיילונג־פּאַראַמעטערס אין דעם IPR און נישט-IPR באַזונדער (פֿיג. 5i). מיר האָבן באמערקט אַז די טיילונג ווינקל פאַרשפּרייטונג אין IPR צעלן איז אַנדערש ווי אין נישט-IPR צעלן אָדער אין צעלן אין די גאנצע SAM, מיט IPR צעלן וואָס ווייַזן אַ העכער פּראָפּאָרציע פון ​​לאַטעראַל/קייַלעכדיק צעל דיוויזשאַנז, ד"ה, 70-80° און 80-90° (33.86% און 30.71%, ריספּעקטיוולי, קאָרעספּאָנדינג פּראָפּאָרציעס) (פיגור 5i). אַזוי, אונדזער אָבסערוואַציעס האָבן גילוי אַ פֿאַרבינדונג צווישן הויך GA סיגנאַלינג און אַ צעל דיוויזשאַן פלאַך אָריענטירונג נאָענט צו די סירקומפערענטשאַל ריכטונג, ענלעך צו די קאָרעלאַציע צווישן GA סיגנאַלינג טעטיקייט און וווּקס אַניזאָטראָפּי (פיגור 5c, d). צו ווייטער באַשטעטיקן די ספּיישאַל קאַנסערוויישאַן פון דעם פֿאַרבינדונג, מיר געמאסטן די טיילונג פלאַך אָריענטירונג אין IPR צעלן אַרום די פּרימאָרדיום סטאַרטינג פון P3, ווייַל די העכסטן GA סיגנאַלינג טעטיקייט איז געווען דיטעקטעד אין דעם געגנט סטאַרטינג פון P4 (פיגור 4). די טיילונג ווינקלען פון די IPR אַרום P3 און P4 האָבן געוויזן קיין סטאַטיסטיש באַטייַטיק דיפעראַנסיז, כאָטש אַ געוואקסן אָפטקייַט פון לאַטעראַל צעל דיוויזשאַנז איז באמערקט אין די IPR אַרום P4 (פיגור 5j). אבער, אין די IPR צעלן ארום P5, איז דער אונטערשייד אין דער אריענטאציע פון ​​דער צעל טיילונג פלאך געווארן סטאטיסטיש באדייטנד, מיט א שאַרפער פאַרגרעסערונג אין דער אָפטקייט פון טראַנסווערס צעל טיילונגען (פיגור 5j). צוזאַמען, פֿאָרשלאָגן די רעזולטאַטן אַז GA סיגנאַלינג קען קאָנטראָלירן די אריענטאציע פון ​​צעל טיילונגען אין די SAM, וואָס איז קאָנסיסטענט מיט פריערדיקע באַריכטן40,41 אַז הויך GA סיגנאַלינג קען פאַראורזאַכן לאַטעראַל אריענטאציע פון ​​צעל טיילונגען אין די IPR.
מען פֿאָרויסזאָגט אַז צעלן אין די IPR וועלן נישט ווערן אײַנגעאַרבעט אין פּרימאָרדיאַ, נאָר גאַנץ אין אינטערנאָדן2,42,43. די טראַנסווערס אָריענטאַציע פֿון צעל טיילונגען אין די IPR קען רעזולטירן אין דער טיפּישער אָרגאַניזאַציע פֿון פּאַראַלעלע לאַנדזשאַטודאַנאַלע רייען פֿון עפּידערמאַלע צעלן אין אינטערנאָדן. אונדזערע אָבסערוואַציעס וואָס זענען באַשריבן אויבן פֿאָרשלאָגן אַז GA סיגנאַלינג שפּילט מסתּמא אַ ראָלע אין דעם פּראָצעס דורך רעגולירן די ריכטונג פֿון צעל טיילונג.
פארלוסט פון פונקציע פון ​​עטלעכע DELLA גענעס רעזולטירט אין א קאנסטיטוטיוון GA רעאקציע, און דעלא מוטאנטן קענען גענוצט ווערן צו טעסטן די היפאטעזע44. מיר האבן ערשט אנאליזירט די אויסדרוק מוסטערן פון פינף DELLA גענעס אין די SAM. טראַנסקריפּציאָנעלע פיוזשאַן פון די GUS ליניע45 האט געוויזן אז GAI, RGA, RGL1, און RGL2 (אין א פיל קלענערער מאָס) זענען אויסגעדריקט געוואָרן אין די SAM (צוגאב בילד 11a-d). אין סיטו כייברידאַזיישאַן האט ווייטער דעמאַנסטרירט אז GAI mRNA אַקיומיאַלייץ ספּעציפֿיש אין פּרימאָרדיאַ און דעוועלאָפּינג בלומען (צוגאב בילד 11e). RGL1 און RGL3 mRNA זענען דעטעקטעד איבער די SAM קאַנאָפּי און אין עלטערע בלומען, כוועראַז RGL2 mRNA איז געווען מער שעפעדיק אין די גרענעץ געגנט (צוגאב בילד 11f-h). קאָנפאָקאַל ימאַגינג פון pRGL3::RGL3-GFP SAM האט באשטעטיקט די אויסדרוק באמערקט דורך אין סיטו כייברידאַזיישאַן און געוויזן אז RGL3 פּראָטעין אַקיומיאַלייץ אין די צענטראַל טייל פון די SAM (צוגאב בילד 11i). ניצנדיק די pRGA::GFP-RGA ליניע, האבן מיר אויך געפונען אז RGA פראטעין זאמלט זיך אן אין די SAM, אבער איר צאל פארקלענערט זיך ביים גרענעץ אנהייבנדיג פון P4 (צוגאב בילד 11j). באמערקענסווערט, די אויסדרוק מוסטערן פון RGL3 און RGA זענען קאנסיסטענט מיט העכערע GA סיגנאלינג אקטיוויטעט אין די IPR, ווי דעטעקטירט דורך qmRGA (פיגור 4). דערצו, די דאטן ווייזן אז אלע DELLAs ווערן אויסגעדריקט אין די SAM און אז זייער אויסדרוק קאלעקטיוו שפאנט די גאנצע SAM.
מיר האָבן ווייטער אַנאַליזירט די צעל טיילונג פּאַראַמעטערס אין די ווילד-טיפּ SAM (Ler, קאָנטראָל) און די gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 דעלאַ קווינטופּל (גלאָבאַל) מוטאַנטן (פיגור 6a, b). אינטערעסאַנט, מיר האָבן באמערקט אַ סטאַטיסטיש באַטייטיק ענדערונג אין די פאַרשפּרייטונג פון צעל טיילונג ווינקל פרעקווענצן אין די דעלאַ גלאָבאַל מוטאַנט SAM קאַמפּערד צו די ווילד טיפּ (פיגור 6c). די ענדערונג אין די דעלאַ גלאָבאַל מוטאַנט איז געווען רעכט צו אַ פאַרגרעסערונג אין די פרעקווענץ פון 80-90° ווינקלען (34.71% קעגן 24.55%) און, צו אַ קלענערער מאָס, 70-80° ווינקלען (23.78% קעגן 20.18%), ד"ה, קאָרעספּאָנדירנדיק צו טראַנסווערס צעל טיילונגען (פיגור 6c). די פרעקווענץ פון ניט-טראַנסווערס טיילונגען (0-60°) איז אויך געווען נידעריקער אין די דעלאַ גלאָבאַל מוטאַנט (פיגור 6c). די פרעקווענץ פון טראַנסווערס צעל טיילונגען איז געווען באַטייטיק געוואקסן אין די SAM פון די דעלאַ גלאָבאַל מוטאַנט (פיגור 6b). די אָפטקייט פון טראַנסווערס צעל דיוויזשאַנז אין די IPR איז אויך געווען העכער אין די דעלאַ גלאָבאַל מוטאַנט קאַמפּערד צו די ווילד טיפּ (פיגור 6ד). אַרויס פון די IPR געגנט, די ווילד טיפּ האט געהאט אַ מער מונדיר פאַרשפּרייטונג פון צעל דיוויזשאַן ווינקלען, כוועראַז די דעלאַ גלאָבאַל מוטאַנט בילכער טאַנגענטשאַל דיוויזשאַנז ווי די IPR (פיגור 6e). מיר אויך קוואַנטיפיצירט די אָריענטירונג פון צעל דיוויזשאַנז אין די SAM פון ga2 אָקסידאַזע ​​(ga2ox) קווינטופּל מוטאַנץ (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, און ga2ox6-2), אַ GA-ינאַקטיוו מוטאַנט הינטערגרונט אין וואָס GA אַקיומיאַלייץ. אין איינקלאַנג מיט דער פאַרגרעסערונג אין GA לעוועלס, איז די SAM פון דער קווינטופּל ga2ox מוטאַנט ינפלאָרעסצענץ געווען גרעסער ווי יענע פון ​​Col-0 (צוגאב בילד 12a, b), און קאַמפּערד צו Col-0, האָט די קווינטופּל ga2ox SAM געוויזן אַ באַזונדער אַנדערש פאַרשפּרייטונג פון צעל טיילונג ווינקלען, מיט דער ווינקל אָפטקייט וואַקסנדיק פון 50° צו 90°, ד"ה ווידער באַגינציקנדיק טאַנגענציעלע טיילונגען (צוגאב בילד 12a-c). אַזוי, ווײַזן מיר אַז קאָנסטיטוטיוו אַקטיוואַציע פון ​​GA סיגנאַלינג און GA אַקיומיאַליישאַן אינדוצירן לאַטעראַל צעל טיילונגען אין די IPR און די רעשט פון די SAM.
a, b 3D וויזואַליזאַציע פון ​​דער L1 שיכט פון PI-געפאַרבט Ler (a) און גלאָבאַל דעלאַ מוטאַנט (b) SAM ניצנדיק קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּיע. נייע צעל ווענט געשאפן אין די SAM (אָבער נישט די פּרימאָרדיום) איבער אַ 10-שעה פּעריאָד ווערן געוויזן און קאָלירט לויט זייערע ווינקל ווערטן. די ינסערט ווייזט די SAM ביי 0 שעה. די קאָליר באַר ווערט געוויזן אין די נידעריקער רעכט ווינקל. דער פייַל אין (b) ווייזט צו אַ בייַשפּיל פון אַליינד צעל טעקעס אין די גלאָבאַל דעלאַ מוטאַנט. דער עקספּערימענט איז געווען ריפּיטיד צוויי מאָל מיט ענלעכע רעזולטאַטן. ce פאַרגלייַך פון די אָפטקייַט פאַרשפּרייטונג פון צעל דיוויזשאַן פלאַך אָריענטיישאַנז אין די גאנצע SAM (d), IPR (e), און ניט-IPR (f) צווישן Ler און גלאָבאַל דעלאַ. P ווערטן זענען באקומען ניצן אַ צוויי-טיילד קאָלמאָגאָראָוו-סמירנאָוו טעסט. f, g 3D וויזואַליזאַציע פון ​​קאָנפאָקאַל בילדער פון PI-געפאַרבט SAM פון Col-0 (i) און pCUC2::gai-1-VENUS (j) טראַנסגעניק געוויקסן. פּאַנעלן (a, b) ווייַזן נייַע צעל ווענט (אָבער נישט פּרימאָרדיאַ) געשאפן אין די SAM אין 10 שעה. דער עקספּערימענט איז געווען ריפּיטיד צוויי מאָל מיט ענלעכע רעזולטאַטן. h–j פאַרגלייַך פון די אָפטקייַט פאַרשפּרייטונג פון צעל טיילונג פלאַך אָריענטיישאַנז לאָוקייטאַד אין די גאנצע SAM (h), IPR (i) און ניט-IPR (j) צווישן Col-0 און pCUC2::gai-1-VENUS געוויקסן. P ווערטן זענען באקומען ניצן אַ צוויי-זייַטיק קאָלמאָגאָראָוו-סמירנאָוו טעסט.
מיר האָבן ווייטער געטעסט דעם עפֿעקט פֿון אינהיביטירן GA סיגנאַלינג ספּעציפֿיש אין די IPR. צו דעם צוועק, האָבן מיר גענוצט דעם קאָטילעדאָן קאַפּ 2 (CUC2) פּראָמאָטער צו טרייבן אויסדרוק פֿון אַ דאָמינאַנט נעגאַטיוו gai-1 פּראָטעין פֿאַרבונדן מיט VENUS (אין דער pCUC2::gai-1-VENUS ליניע). אין דעם ווילד-טיפּ SAM, טרייבט דער CUC2 פּראָמאָטער אויסדרוק פֿון רובֿ IPRs אין דעם SAM, אַרייַנגערעכנט גרענעץ צעלן, פֿון P4 און ווייטער, און ענלעכע ספּעציפֿישע אויסדרוק איז באמערקט געוואָרן אין pCUC2::gai-1-VENUS געוויקסן (זען אונטן). די פֿאַרטיילונג פֿון צעל טיילונג ווינקלען אַריבער דעם SAM אָדער IPR פֿון pCUC2::gai-1-VENUS געוויקסן איז נישט געווען באַדייטנד אַנדערש פֿון יענעם פֿון דעם ווילד טיפּ, כאָטש אומגעריכט האָבן מיר געפֿונען אַז צעלן אָן אַן IPR אין די געוויקסן האָבן זיך צעטיילט מיט אַ העכערער פֿרעקווענץ פֿון 80–90° (פֿיג. 6f–j).
מען האט פארגעשלאגן אז די ריכטונג פון צעל טיילונג איז אפהענגיק פון דער געאמעטריע פון ​​די SAM, ספעציעל דעם צוגאנגס-שטראם וואס ווערט גענערירט דורך דער געוועב קרומונג46. מיר האבן דעריבער געפרעגט צי די פארעם פון די SAM איז געענדערט געווארן אין די della global mutant און pCUC2::gai-1-VENUS פלאנצן. ווי פריער באריכטעט12, די גרייס פון די della global mutant SAM איז געווען גרעסער ווי די פון די ווילד טיפ (צוגאב בילד 13a, b, d). אין סיטו כייברידיזאציע פון ​​CLV3 און STM RNA האט באשטעטיקט די מעריסטעם אויסברייטונג אין דעלא מוטאנטן און ווייטער געוויזן די לאַטעראַלע אויסברייטונג פון די סטעם צעל נישע (צוגאב בילד 13e, f, h, i). אבער, די SAM קרומונג איז געווען ענלעך אין ביידע גענאטיפן (צוגאב בילד 13k, m, n, p). מיר האבן באמערקט א ענליכע פארגרעסערונג אין גרייס אין די gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della קוואַדרופּל מוטאַנט אָן א ענדערונג אין קרומונג קאַמפּערד צו די ווילד טיפ (צוגאב בילד 13c, d, g, j, l, o, p). די אָפטקייט פון צעל טיילונג אָריענטאַציע איז אויך געווען אַפעקטירט אין די דעלאַ קוואַדרופּל מוטאַנט, אָבער צו אַ קלענערער מאָס ווי אין די דעלאַ מאָנאָליטישע מוטאַנט (סאַפּלעמענטאַרי פיג. 12ד-ו). דעם דאָוסאַדזש ווירקונג, צוזאַמען מיט די פעלן פון אַן ווירקונג אויף קרומונג, סאַגדזשעסט אַז רעשט RGL3 טעטיקייט אין די דעלאַ קוואַדרופּל מוטאַנט לימיטירט ענדערונגען אין צעל טיילונג אָריענטאַציע געפֿירט דורך אָנווער פון DELLA טעטיקייט און אַז ענדערונגען אין לאַטעראַל צעל דיוויזשאַנז פּאַסירן אין ענטפער צו ענדערונגען אין GA סיגנאַלינג טעטיקייט אלא ווי ענדערונגען אין SAM דזשיאַמאַטרי. ווי דיסקרייבד אויבן, די CUC2 פּראָמאָטער טרייבט IPR אויסדרוק אין די SAM סטאַרטינג ביי P4 (סאַפּלעמענטאַרי פיג. 14אַ, ב), און אין קאַנטראַסט, די pCUC2::gai-1-VENUS SAM האט אַ רידוסט גרייס אָבער העכער קרומונג (סאַפּלעמענטאַרי פיג. 14ק-ה). דעם ענדערונג אין pCUC2::gai-1-VENUS SAM מאָרפאָלאָגיע קען רעזולטאַט אין אַ אַנדערש פאַרשפּרייטונג פון מעטשאַניקאַל סטרעסאַז קאַמפּערד צו די ווילד טיפּ, אין וואָס הויך סירקומפערענטשאַל סטרעסאַז אָנהייבן ביי אַ קירצער דיסטאַנסע פון ​​די SAM צענטער47. אדער, די ענדערונגען אין pCUC2::gai-1-VENUS SAM מארפאלאגיע קענען רעזולטירן פון ענדערונגען אין רעגיאנאלע מעכאנישע אייגנשאפטן אינדוצירט דורך טראנסגענע אויסדרוק48. אין ביידע פעלער, קען דאס טיילווייז אפזעצן די עפעקטן פון ענדערונגען אין GA סיגנאלינג דורך פארגרעסערן די מעגלעכקייט אז צעלן וועלן זיך צעטיילן אין די סירקומפערענציעלע/טרענסווערסע אריענטאציע, וואס דערקלערט אונזערע אבזערוואציעס.
צוזאַמען גענומען, באַשטעטיקן אונדזערע דאַטן אַז העכערע GA סיגנאַלינג שפּילט אַן אַקטיווע ראָלע אין דער לאַטעראַלער אָריענטאַציע פון ​​דער צעל טיילונג פלאַך אין די IPR. זיי ווייַזן אויך אַז מעריסטעם קרומונג אויך השפּעה די אָריענטאַציע פון ​​דער צעל טיילונג פלאַך אין די IPR.
די טראַנסווערס אָריענטאַציע פון ​​דער דיוויזשאַן פלאַך אין די IPR, רעכט צו הויך GA סיגנאַלינג טעטיקייט, סאַגדזשעסט אַז GA פאַר-אָרגאַניזירט אַ ראַדיאַל צעל טעקע אין די עפּאַדערמיס אין די SAM צו דעפינירן די צעלולאַרע אָרגאַניזאַציע וואָס וועט שפּעטער געפֿונען ווערן אין די עפּידערמאַל ינטערנאָדע. טאַקע, אַזאַ צעל טעקעס זענען אָפט קענטיק אין SAM בילדער פון דעלאַ גלאָבאַל מוטאַנץ (פיגור 6ב). אַזוי, צו ווייטער ויספאָרשן די אַנטוויקלונג פונקציע פון ​​די ספּיישאַל מוסטער פון GA סיגנאַלינג אין די SAM, מיר האָבן געניצט צייט-פאַרשפּעטיקונג ימאַגינג צו אַנאַליזירן די ספּיישאַל אָרגאַניזאַציע פון ​​סעלז אין די IPR אין ווילד-טיפּ (Ler און Col-0), דעלאַ גלאָבאַל מוטאַנץ, און pCUC2::gai-1-VENUS טראַנסגעניק געוויקסן.
מיר האָבן געפֿונען אַז qmRGA האָט געוויזן אַז GA סיגנאַלינג אַקטיוויטעט אין די IPR האָט זיך געוואַקסן פֿון P1/P2 און דערגרייכט דעם שפּיץ ביי P4, און דאָס מוסטער איז געבליבן קאָנסטאַנט איבער צייט (פֿיגור 4a–f און סאַפּלעמענטאַרי פֿיגור 8c–f, k). כּדי צו אַנאַליזירן די ספּיישאַל אָרגאַניזאַציע פֿון צעלן אין די IPR מיט וואַקסנדיקן GA סיגנאַל, האָבן מיר באַצייכנט Ler IPR צעלן אויבן און צו די זייטן פֿון P4 לויט זייער אַנטוויקלונגס גורל אַנאַליזירט 34 שעה נאָך דער ערשטער אָבסערוואַציע, ד״ה מער ווי צוויי פּלאַסטיד מאָל, וואָס האָט אונדז דערלויבט צו פֿאָלגן IPR צעלן בעת ​​פּרימאָרדיום אַנטוויקלונג פֿון P1/P2 צו P4. מיר האָבן גענוצט דריי פֿאַרשידענע פֿאַרבן: געל פֿאַר יענע צעלן וואָס זענען געווען אינטעגרירט אין די פּרימאָרדיום לעבן P4, גרין פֿאַר יענע וואָס זענען געווען אין די IPR, און לילאַ פֿאַר יענע וואָס האָבן זיך באַטייליקט אין ביידע פּראָצעסן (פֿיגור 7a–c). ביי t0 (0 h), זענען 1–2 לייַערס פֿון IPR צעלן געווען קענטיק פֿאַר P4 (פֿיגור 7a). ווי געריכט, ווען די צעלן האָבן זיך צעטיילט, האָבן זיי דאָס געטאָן הויפּטזעכלעך דורך די טראַנסווערסאַלע דיוויזשאַן פלאַך (פֿיגורן 7a–c). ענלעכע רעזולטאטן זענען באקומען געווארן ניצנדיק Col-0 SAM (פאָקוסירנדיק אויף P3, וועמענס גרענעץ פאָלדט זיך ענלעך צו P4 אין Ler), כאָטש אין דעם גענאָטיפּ האָט די פאָלד וואָס איז געפֿאָרעמט געוואָרן ביים בלומען-גרענעץ שנעלער באַהאַלטן די IPR צעלן (פיגור 7g–i). אַזוי, דער טיילונגס-מוסטער פֿון IPR צעלן פאַר-אָרגאַניזירט די צעלן אין ראַדיאַלע רייען, ווי אין אינטערנאָדן. די אָרגאַניזאַציע פֿון ראַדיאַלע רייען און די לאָקאַליזאַציע פֿון IPR צעלן צווישן נאָכפֿאָלגנדיקע אָרגאַנען פֿאָרשלאָגן אַז די צעלן זענען אינטערנאָדאַל פּראָגעניטאָרס.
דאָ, האָבן מיר אַנטוויקלט אַ ראַטיאָמעטרישער GA סיגנאַלינג ביאָסענסאָר, qmRGA, וואָס דערמעגלעכט קוואַנטיטאַטיווע מאַפּינג פון GA סיגנאַלינג אַקטיוויטעט וואָס רעזולטירט פון קאַמביינד GA און GA רעצעפּטאָר קאָנצענטראַציעס בשעת מינימיזירן ינטערפיראַנס מיט ענדאָגענע סיגנאַלינג פּאַטווייז, דערמיט פּראַוויידינג אינפֿאָרמאַציע וועגן GA פונקציע אויף די צעלולאַרע מדרגה. צו דעם צוועק, האָבן מיר קאַנסטראַקטאַד אַ מאָדיפיצירט DELLA פּראָטעין, mRGA, וואָס האט פאַרלאָרן די פיייקייט צו בינדן DELLA ינטעראַקשאַן פּאַרטנערס אָבער בלייבט סענסיטיוו צו GA-ינדוסט פּראָטעאָליסיס. qmRGA רעאַגירט צו ביידע עקסאָגענע און ענדאָגענע ענדערונגען אין GA לעוועלס, און זייַן דינאַמיש סענסינג פּראָפּערטיעס דערמעגלעכן אַסעסמאַנט פון ספּאַטיאָטעמפּאָראַל ענדערונגען אין GA סיגנאַלינג אַקטיוויטעט בעשאַס אַנטוויקלונג. qmRGA איז אויך אַ זייער פלעקסאַבאַל געצייַג ווייַל עס קען זיין אַדאַפּטיד צו פאַרשידענע געוועבן דורך טשאַנגינג די פּראָמאָטער געניצט פֿאַר זייַן אויסדרוק (אויב נייטיק), און געגעבן די קאָנסערווירט נאַטור פון די GA סיגנאַלינג פּאַטוויי און די PFYRE מאָטיוו אַריבער אַנגיאָספּערמס, איז עס מסתּמא צו זיין טראַנספעראַבאַל צו אנדערע מינים22. אין איינקלאַנג מיט דעם, איז אויך געוויזן געוואָרן אַז אַן עקוויוואַלענטע מוטאַציע אין דעם רייז SLR1 DELLA פּראָטעין (HYY497AAA) אונטערדריקט די וואוקס רעפּרעסאָר טעטיקייט פון SLR1 בשעת עס רעדוצירט בלויז אַ ביסל זיין GA-מעדיאַטעד דעגראַדאַציע, ענלעך צו mRGA23. באַמערקענסווערט, לעצטע שטודיעס אין אַראַבידאָפּסיס האָבן געוויזן אַז אַן איינציקע אַמינאָ זויער מוטאַציע אין דעם PFYRE דאָמעין (S474L) האָט געביטן די טראַנסקריפּציאָנעלע טעטיקייט פון RGA אָן צו ווירקן זיין פיייקייט צו ינטעראַקט מיט טראַנסקריפּציע פאַקטאָר פּאַרטנערס50. כאָטש די מוטאַציע איז זייער נאָענט צו די 3 אַמינאָ זויער סאַבסטיטוציעס פאָרשטעלן אין mRGA, ווייַזן אונדזערע שטודיעס אַז די צוויי מוטאַציעס טוישן באַזונדערע קעראַקטעריסטיקס פון DELLA. כאָטש רובֿ טראַנסקריפּציע פאַקטאָר פּאַרטנערס בינדן צו די LHR1 און SAW דאָמעינען פון DELLA26,51, קענען עטלעכע קאָנסערווירטע אַמינאָ זויערן אין דעם PFYRE דאָמעין העלפֿן סטאַביליזירן די ינטעראַקשאַנז.
אינטערנאָוד אַנטוויקלונג איז אַ שליסל שטריך אין פלאַנצן אַרכיטעקטור און ייעלד פֿאַרבעסערונג. qmRGA האט געוויזן העכער GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין IPR אינטערנאָוד פּראָגעניטאָר סעלז. דורך קאַמביינינג קוואַנטיטאַטיווע ימאַגינג און דזשאַנעטיק, מיר געוויזן אַז GA סיגנאַלינג פּאַטערנז סופּערימפּאָסע קייַלעכדיק / טראַנסווערס צעל דיוויזשאַן פּליינז אין די SAM עפּאַדערמיס, פאָרמינג די צעל דיוויזשאַן אָרגאַניזאַציע פארלאנגט פֿאַר אינטערנאָוד אַנטוויקלונג. עטלעכע רעגולאַטאָרס פון צעל דיוויזשאַן פלאַך אָריענטירונג זענען געווען יידענטאַפייד בעשאַס אַנטוויקלונג 52,53. אונדזער אַרבעט גיט אַ קלאָר בייַשפּיל פון ווי GA סיגנאַלינג טעטיקייט רעגיאַלייץ דעם צעלולאַר פּאַראַמעטער. DELLA קענען ינטעראַקט מיט פּרעפאָולדינג פּראָטעין קאָמפּלעקסעס 41, אַזוי GA סיגנאַלינג קען רעגולירן צעל דיוויזשאַן פלאַך אָריענטירונג דורך דירעקט ינפלוענסינג קאָרטיקאַל מיקראָטובולע ​​אָריענטירונג 40,41,54,55. מיר אומגעריכט געוויזן אַז אין SAM, די קאָרעלאַט פון העכער GA סיגנאַלינג טעטיקייט איז נישט צעל ילאָנגגיישאַן אָדער דיוויזשאַן, אָבער בלויז וווּקס אַניזאָטראָפּי, וואָס איז קאָנסיסטענט מיט אַ דירעקט ווירקונג פון GA אויף די ריכטונג פון צעל דיוויזשאַן אין די IPR. אָבער, מיר קענען נישט ויסשליסן אַז דעם ווירקונג קען אויך זיין ומדירעקט, למשל מעדיאַטעד דורך GA-ינדוסט צעל וואַנט סאָפאַנינג 56. ענדערונגען אין צעל וואַנט אייגנשאַפטן פאַראורזאַכן מעכאַנישע דרוק57,58, וואָס קען אויך השפּעה האָבן אויף דער אָריענטאַציע פון ​​דער צעל טיילונג פלאַך דורך ווירקן אויף דער אָריענטאַציע פון ​​קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס39,46,59. די קאָמבינירטע ווירקונגען פון GA-ינדוסט מעכאַנישע דרוק און דירעקט רעגולאַציע פון ​​מיקראָטובולע ​​אָריענטאַציע דורך GA קען זיין ינוואַלווד אין דזשענערייטינג אַ ספּעציפיש מוסטער פון צעל טיילונג אָריענטאַציע אין די IPR צו דעפינירן ינטערנאָדעס, און ווייטערדיקע שטודיעס זענען דארף צו פּרובירן דעם געדאַנק. סימילאַרלי, פריערדיקע שטודיעס האָבן כיילייטיד די וויכטיקייט פון די DELLA-ינטעראַקטינג פּראָטעינס TCP14 און 15 אין די קאָנטראָל פון ינטערנאָדע פאָרמאַציע60,61 און די סיבות קען מעדיאַטירן די קאַמף פון GA צוזאַמען מיט BREVIPEDICELLUS (BP) און PENNYWISE (PNY), וואָס רעגולירן ינטערנאָדע אַנטוויקלונג און האָבן געוויזן צו השפּעה האָבן אויף GA סיגנאַלינג2,62. געגעבן אַז DELLAs אינטעראַקטירן מיט בראַססינאָסטערויד, עטאַלין, יאַסמאָניק זויער, און אַבססיסיק זויער (ABA) סיגנאַלינג פּאַטווייז63,64 און אַז די האָרמאָנעס קענען השפּעה האָבן אויף מיקראָטובול אָריענטירונג65, די יפעקץ פון GA אויף צעל טיילונג אָריענטירונג קען אויך זיין מעדיאַטעד דורך אנדערע האָרמאָנעס.
פריע ציטאָלאָגישע שטודיעס האָבן געוויזן אַז ביידע די אינעווייניקסטע און אויסווייניקסטע געגנטן פון די אַראַבידאָפּסיס SAM זענען נויטיק פֿאַר אינטערנאָדע אַנטוויקלונג2,42. דער פאַקט אַז GA אַקטיוו רעגולירט צעל טיילונג אין די אינעווייניקסטע געוועבן12 שטיצט אַ צווייפאַכע פֿונקציע פון ​​GA אין רעגולירן מעריסטעם און אינטערנאָדע גרייס אין די SAM. די מוסטער פון דירעקשאַנאַל צעל טיילונג איז אויך שטרענג רעגולירט אין די אינעווייניקסטע SAM געוועב, און דעם רעגולאַציע איז יקערדיק פֿאַר שטאַם וווּקס52. עס וועט זיין אינטערעסאנט צו ונטערזוכן צי GA שפּילט אויך אַ ראָלע אין אָריענטירן די צעל טיילונג פלאַך אין די אינעווייניקסטע SAM אָרגאַניזאַציע, דערמיט סינקראָניזינג די ספּעסיפֿיקאַציע און אַנטוויקלונג פון אינטערנאָדעס אין די SAM.
פלאַנצן זענען געוואַקסן אין וויטראָ אין באָדן אָדער 1x מוראַשיגע-סקאָאָג (MS) מעדיום (דוטשעפאַ) סופּלעמענטירט מיט 1% סוכראָז און 1% אַגאַר (סיגמאַ) אונטער נאָרמאַלע באַדינגונגען (16 שעה ליכט, 22 °C), אַחוץ פֿאַר היפּאָקאָטיל און וואָרצל וווּקס עקספּערימענטן אין וועלכע זוימען זענען געוואַקסן אויף ווערטיקאַלע פּלאַטעס אונטער קאָנסטאַנט ליכט און 22 °C. פֿאַר נייטרייט עקספּערימענטן, פלאַנצן זענען געוואַקסן אויף מאָדיפיצירט MS מעדיום (bioWORLD פלאַנצן מעדיום) סופּלעמענטירט מיט גענוג נייטרייט (0 אָדער 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-סוקסינאַט, 1% סוכראָז און 1% A-אַגאַר (סיגמאַ) אונטער לאַנג-טאָג באַדינגונגען.
GID1a cDNA איינגעשטעלט אין pDONR221 איז רעקאָמבינירט געוואָרן מיט pDONR P4-P1R-pUBQ10 און pDONR P2R-P3-mCherry אין pB7m34GW צו שאַפֿן pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA איינגעשטעלט אין pDONR221 איז רעקאָמבינירט געוואָרן אין pB7RWG266 צו שאַפֿן p35S:IDD2-RFP. כדי צו שאַפֿן pGID1b::2xmTQ2-GID1b, זענען אַ 3.9 קב פֿראַגמענט אַרויף פֿון דער GID1b קאָדירנדיקער געגנט און אַ 4.7 קב פֿראַגמענט וואָס ענטהאַלט די GID1b cDNA (1.3 קב) און טערמינאַטאָר (3.4 קב) ערשט אַמפּליפֿיצירט געוואָרן מיט די פּריימערס אין סאַפּלעמענטאַרי טאַבעלע 3 און דערנאָך אַרייַנגעשטעלט אין pDONR P4-P1R (טהערמאָ פֿישער סייענטיפיק) און pDONR P2R-P3 (טהערמאָ פֿישער סייענטיפיק), ריספּעקטיוולי, און לעסאָף רעקאָמבינירט מיט pDONR221 2xmTQ268 אין דעם pGreen 012567 ציל וועקטאָר מיט גייטוויי קלאָונינג. כדי צו דזשענערירן pCUC2::LSSmOrange, איז די CUC2 פּראָמאָטער סיקוואַנס (3229 bp אַפּסטרים פון ATG) נאכגעפאָלגט דורך די קאָדירונג סיקוואַנס פון גרויס סטאָוקס-שיפטעד mOrange (LSSmOrange)69 מיטן N7 נוקלעאַר לאָקאַליזאַציע סיגנאַל און דעם NOS טראַנסקריפּשאַנאַל טערמינאַטאָר צוזאַמענגעשטעלט געוואָרן אין דעם pGreen קאַנאַמיצין טאַרגעטינג וועקטאָר ניצנדיק דעם Gateway 3-פראַגמענט רעקאָמבינאַציע סיסטעם (Invitrogen). דער פלאַנצן בינערי וועקטאָר איז איינגעפירט געוואָרן אין Agrobacterium tumefaciens שטאַם GV3101 און איינגעפירט אין Nicotiana benthamiana בלעטער דורך Agrobacterium אינפילטראַציע מעטאָד און אין Arabidopsis thaliana Col-0 דורך פלאָראַל טונק מעטאָד, ריספּעקטיוולי. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry און pCLV3::mCherry-NLS qmRGA זענען אפגעזונדערט געוואָרן פון די F3 און F1 פּראָגעניס פון די ריספּעקטיוו קראָסיז, ריספּעקטיוולי.
RNA אין סיטו כייברידיזאַציע איז דורכגעפירט געוואָרן אויף אַרום 1 סענטימעטער לאַנגע שפּראָץ שפּיץ72, וועלכע זענען געזאַמלט געוואָרן און גלייך פיקסירט אין FAA לייזונג (3.7% פאָרמאַלדעהייד, 5% עסיק זויער, 50% עטאַנאָל) פאַר-געקילט צו 4 °C. נאָך 2 × 15 מינוט וואַקוום באַהאַנדלונגען, איז דער פיקסאַטיוו געביטן געוואָרן און מוסטערן זענען אינקובירט געוואָרן איבער נאַכט. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, און RGL3 cDNAs און אַנטיסענס פּראָובז צו זייערע 3′-UTRs זענען סינטעזירט געוואָרן מיט די פּריימערס געוויזן אין סאַפּלעמענטאַרי טאַבעלע 3 ווי באַשריבן דורך ראָסיע et al.73. דיגאָקסיגענין-מארקירטע פּראָבעס זענען ימיונאָדעטעקטעד געוואָרן מיט דיגאָקסיגענין אַנטיקערפּערס (3000-פאַכיקע דיילושאַן; ראָוש, קאַטאַלאָג נומער: 11 093 274 910), און סעקשאַנז זענען געפֿאַרבט געוואָרן מיט 5-בראָמאָ-4-כלאָראָ-3-ינדאָליל פאָספאַט (BCIP, 250-פאַכיקע דיילושאַן)/ניטראָבלוי טעטראַזאָליום (NBT, 200-פאַכיקע דיילושאַן) לייזונג.