קוואַנטיטאַטיווע גיבבערעללין ביאָסענסאָר ריווילז די ראָלע פון ​​​​גיבבערעללינס אין ינטערנאָדע ספּעסאַפאַקיישאַנז אין די דרייען אַפּיקאַל מעריסטעם

גראָוט פון אַפּיקאַל מעריסטעם (SAM) איז קריטיש פֿאַר סטעם אַרקאַטעקטשער. פּלאַנט כאָרמאָונזגיבערעללינס(GAs) שפּילן שליסל ראָלעס אין קאָואָרדאַנייטינג פאַבריק וווּקס, אָבער זייער ראָלע אין די SAM בלייבט שוואַך פארשטאנען. דאָ, מיר דעוועלאָפּעד אַ פאַרהעלטעניש ביאָסענסאָר פון GA סיגנאַלינג דורך ינזשעניעריע די DELLA פּראָטעין צו פאַרשטיקן זיין יקערדיק רעגולאַטאָרי פונקציע אין די GA טראַנסקריפּציע ענטפער בשעת פּראַזערווינג זיין דערנידעריקונג אויף GA דערקענונג. מיר באַווייַזן אַז דעם דערנידעריקונג-באזירט ביאָסענסאָר אַקיעראַטלי רעקאָרדס ענדערונגען אין GA לעוועלס און סעליאַלער סענסינג בעשאַס אַנטוויקלונג. מיר געוויינט דעם ביאָסענסאָר צו מאַפּע GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין די SAM. מיר ווייַזן אַז הויך GA סיגנאַלז זענען פּרידאַמאַנאַנטלי פאָרשטעלן אין סעלז ליגן צווישן אָרגאַן פּרימאָרדיאַ, וואָס זענען פּריקערסערז צו ינטערנאָדע סעלז. ניצן גיינז און אָנווער-פון-פונקציע אַפּראָוטשיז, מיר ווייַטער באַווייַזן אַז GA רעגיאַלייץ די אָריענטירונג פון די צעל אָפּטייל פלאַך, גרינדן די קאַנאַנאַקאַל סעליאַלער אָרגאַניזאַציע פון ​​ינטערנאָדעס, און דערמיט העכערן ינטערנאָדע ספּעסאַפאַקיישאַנז אין די SAM.
די שאָס אַפּיקאַל מעריסטעם (SAM), ליגן בייַ די שאָס אַפּעקס, כּולל אַ נישע פון ​​סטעם סעלז וועמענס טעטיקייט דזשענערייץ לאַטעראַל אָרגאַנס און סטעם נאָודז אויף אַ מאַדזשאַלער און יטעראַטיוו שטייגער איבער די לעבן פון די פאַבריק. יעדער פון די ריפּיטינג וניץ, אָדער פאַבריק נאָודז, ינקלודז ינטערנאָדעס און לאַטעראַל אָרגאַנס אין די נאָודז, און אַקסיללאַרי מעריסטאַמז אין די בלאַט אַקסילס1. דער וווּקס און אָרגאַניזאַציע פון ​​פאַבריק נאָודז ענדערונגען בעשאַס אַנטוויקלונג. אין אַראַבידאָפּסיס, ינטערנאָדאַל וווּקס איז סאַפּרעסט בעשאַס די וועדזשאַטייטיוו בינע, און אַקסיללאַרי מעריסטאַמז בלייבן דאָרמאַנט אין די אַקסילס פון ראָסעט בלעטער. בעשאַס די יבערגאַנג צו די פלאָראַל פאַסע, די סאַם ווערט די ינפלאָרעססענסע מעריסטעם, דזשענערייטינג ילאָנגגייטאַד ינטערנאָדעס און אַקסיללאַרי באַדז, בראַנטאַלז אין די אַקסילס פון קאַולינע בלעטער, און שפּעטער, ליפלאָסע בלומען 2. כאָטש מיר האָבן געמאכט באַטייַטיק פּראָגרעס אין פארשטאנד די מעקאַניזאַמז וואָס קאָנטראָלירן די ינישיישאַן פון בלעטער, בלומען און צווייגן, לעפיערעך קליין איז באַוווסט וועגן ווי ינטערנאָדעס אויפשטיין.
פארשטאנד פון די ספּאַטיאָטעמפּאָראַל פאַרשפּרייטונג פון גאַס וועט העלפֿן צו בעסער פֿאַרשטיין די פאַנגקשאַנז פון די כאָרמאָונז אין פאַרשידענע געוועבן און אין פאַרשידענע אַנטוויקלונג סטאַגעס. וויסואַליזאַטיאָן פון די דערנידעריקונג פון RGA-GFP פוסיאָן אויסגעדריקט אונטער דער קאַמף פון זיין אייגענע פּראָמאָטער גיט וויכטיק אינפֿאָרמאַציע וועגן די רעגולירן פון גאַנץ GA לעוועלס אין רוץ15,16. אָבער, RGA אויסדרוק וועריז צווישן געוועבן17 און איז רעגיאַלייטאַד דורך GA18. אזוי, די דיפערענטשאַל אויסדרוק פון די RGA פּראָמאָטער קען רעזולטאַט אין די פלואָרעססענסע מוסטער באמערקט מיט RGA-GFP און אַזוי דעם אופֿן איז נישט קוואַנטיטאַטיווע. מער לעצטנס, ביאָאַקטיווע פלואָרעססעין (Fl)-לייבאַלד GA19,20 אנטפלעקט די אַקיומיאַליישאַן פון GA אין די וואָרצל ענדאָקאָרטעקס און די רעגולירן פון זייַן סעליאַלער לעוועלס דורך GA אַריבערפירן. לעצטנס, די GA FRET סענסער nlsGPS1 געוויזן אַז GA לעוועלס קאָראַלייטיד מיט צעל ילאָנגגיישאַן אין רוץ, פילאַמאַנץ און טונקל-דערוואַקסן היפּאָקאָטילס21. אָבער, ווי מיר האָבן געזען, GA קאַנסאַנטריישאַן איז נישט דער בלויז פּאַראַמעטער קאַנטראָולינג GA סיגנאַלינג טעטיקייט, ווייַל עס דעפּענדס אויף קאָמפּלעקס סענסינג פּראַסעסאַז. דאָ, געבויט אויף אונדזער פארשטאנד פון די DELLA און GA סיגנאַלינג פּאַטווייז, מיר באַריכט די אַנטוויקלונג און כאַראַקטעריזיישאַן פון אַ דערנידעריקונג-באזירט ריישיאָומעטריק ביאָסענסאָר פֿאַר GA סיגנאַלינג. צו אַנטוויקלען דעם קוואַנטיטאַטיווע ביאָסענסאָר, מיר געוויינט אַ מוטאַנט GA-שפּירעוודיק רגאַ וואָס איז געווען פיוזד צו אַ פלורעסאַנט פּראָטעין און ומעטומיק אויסגעדריקט אין געוועבן, ווי געזונט ווי אַ GA-ינסענסיטיוו פלורעסאַנט פּראָטעין. מיר ווייַזן אַז די מיוטאַנט RGA פּראָטעין פיוזשאַנז טאָן ניט אַרייַנמישנ זיך מיט ענדאָגענאָוס GA סיגנאַלינג ווען ומעטומיק אויסגעדריקט, און אַז דעם ביאָסענסאָר קענען קוואַנטיפיצירן סיגנאַלינג טעטיקייט ריזאַלטינג פון ביידע GA אַרייַנשרייַב און GA סיגנאַל פּראַסעסינג דורך די סענסינג אַפּאַראַט מיט הויך ספּאַטיאָטעמפּאָראַל האַכלאָטע. מיר געוויינט דעם ביאָסענסאָר צו מאַפּע די ספּאַטיאָטעמפּאָראַל פאַרשפּרייטונג פון GA סיגנאַלינג טעטיקייט און קוואַנטאַפייז ווי GA רעגיאַלייץ סעליאַלער נאַטור אין די SAM עפּידעמיס. מיר באַווייַזן אַז GA רעגיאַלייץ די אָריענטירונג פון די אָפּטייל פלאַך פון SAM סעלז ליגן צווישן אָרגאַן פּרימאָרדיאַ, דערמיט דיפיינינג די קאַנאַנאַקאַל סעליאַלער אָרגאַניזאַציע פון ​​די ינטערנאָדע.
צום סוף, מיר געפרעגט צי qmRGA קען באַריכט ענדערונגען אין ענדאָגענאָוס GA לעוועלס מיט גראָוינג היפּאָקאָטילס. מיר פריער געוויזן אַז נייטרייט סטימיאַלייץ וווּקס דורך ינקריסינג GA סינטעז און, אין קער, DELLA34 דערנידעריקונג. אַקקאָרדינגלי, מיר באמערקט אַז היפּאָקאָטיל לענג אין פּובק10 :: קמרגאַ סידלינגז דערוואַקסן אונטער שעפעדיק נייטרייט צושטעלן (10 מם נאָ3-) איז באטייטיק מער ווי אַז אין סידלינגז דערוואַקסן אונטער נייטרייט-דיפישאַנט טנאָים (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 6 אַ). קאָנסיסטענט מיט די וווּקס ענטפער, GA סיגנאַלז זענען העכער אין היפּאָקאָטילס פון סידלינגז דערוואַקסן אונטער 10 מם NO3- טנאָים ווי אין סידלינגז דערוואַקסן אין דער אַוועק פון נייטרייט (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 6ב, C). אזוי, qmRGA אויך ינייבאַלז מאָניטאָרינג פון ענדערונגען אין GA סיגנאַלינג ינדוסט דורך ענדאָגענאָוס ענדערונגען אין GA קאַנסאַנטריישאַן.
צו פֿאַרשטיין צי די GA סיגנאַלינג טעטיקייט דיטעקטאַד דורך qmRGA דעפּענדס אויף GA קאַנסאַנטריישאַן און GA מערקונג, ווי דערוואַרט באזירט אויף די סענסער פּלאַן, מיר אַנאַלייזד די אויסדרוק פון די דריי GID1 ראַסעפּטערז אין וועדזשאַטייטיוו און רעפּראָדוקטיווע געוועבן. אין סידלינגז, די GID1-GUS רעפּאָרטער שורה געוויזן אַז GID1a און C זענען העכסט אויסגעדריקט אין קאָטילעדאָנס (Fig. 3a-c). אין דערצו, אַלע דריי ראַסעפּטערז זענען אויסגעדריקט אין בלעטער, לאַטעראַל וואָרצל פּרימאָרדיאַ, וואָרצל עצות (אַחוץ פֿאַר די וואָרצל היטל פון GID1b), און די וואַסקיאַלער סיסטעם (Fig. 3a-c). אין די ינפלאָרעססענסע סאַם, מיר דיטעקטאַד GUS סיגנאַלז בלויז פֿאַר GID1b און 1c (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 7 אַ-C). אין סיטו כייברידיזיישאַן באשטעטיקט די אויסדרוק פּאַטערנז און ווייַטער דעמאַנסטרייטיד אַז GID1c איז יונאַפאָרמלי אויסגעדריקט אין נידעריק לעוועלס אין די סאַם, כוועראַז GID1b געוויזן העכער אויסדרוק אין די פּעריפעריע פון ​​די סאַם (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 7 ד-ל). די pGID1b::2xmTQ2-GID1b איבערזעצונג פוסיאָן אויך אנטפלעקט אַ גראַדעד קייט פון GID1b אויסדרוק, פון נידעריק אָדער קיין אויסדרוק אין די צענטער פון די סאַם צו הויך אויסדרוק אין די אָרגאַן געמארקן (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 7m). אזוי, GID1 ראַסעפּטערז זענען נישט יונאַפאָרמלי פונאנדערגעטיילט אַריבער און אין געוועבן. אין סאַבסאַקוואַנט יקספּעראַמאַנץ, מיר אויך באמערקט אַז אָוווערעקספּרעססיאָן פון GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) געוואקסן די סענסיטיוויטי פון qmRGA אין היפּאָקאָטילס צו פונדרויסנדיק GA אַפּלאַקיישאַן (Fig. 3d, E). אין קאַנטראַסט, פלורעסאַנס געמאסטן דורך qd17mRGA אין די היפּאָקאָטיל איז ינסענסיטיוו צו GA3 באַהאַנדלונג (Fig. 3f, g). פֿאַר ביידע אַסאַסאַז, סידלינגז זענען באהאנדלט מיט הויך קאַנסאַנטריישאַנז פון GA (100 μM GA3) צו אַססעסס די גיך נאַטור פון די סענסער, ווו די פיייקייט צו בינדן צו די GID1 רעסעפּטאָר איז ימפּרוווד אָדער פאַרפאַלן. צוזאַמען, די רעזולטאַטן באַשטעטיקן אַז די qmRGA ביאָסענסאָר סערוועס אַ קאַמביינד פֿונקציע ווי אַ GA און GA סענסער, און פֿאָרשלאָגן אַז די דיפערענטשאַל אויסדרוק פון די GID1 רעסעפּטאָר קענען באטייטיק מאָדולירן די עמיסיוואַטי פון די סענסער.
ביז אַהער, די פאַרשפּרייטונג פון GA סיגנאַלז אין די SAM בלייבט ומקלאָר. דעריבער, מיר געוויינט qmRGA-עקספּרעסינג געוויקסן און די pCLV3 :: mCherry-NLS סטעם צעל רעפּאָרטער 35 צו רעכענען הויך-האַכלאָטע קוואַנטיטאַטיווע מאַפּס פון GA סיגנאַלינג טעטיקייט, פאָוקיסינג אויף די ל 1 שיכטע (עפּידעמיס; Fig. דאָ, pCLV3 :: mCherry-NLS אויסדרוק צוגעשטעלט אַ פאַרפעסטיקט דזשיאַמעטריק רעפֿערענץ פונט פֿאַר אַנאַלייזינג די ספּאַטיאָטעמפּאָראַל פאַרשפּרייטונג פון GA סיגנאַלינג טעטיקייט37. כאָטש GA איז גערעכנט ווי יקערדיק פֿאַר לאַטעראַל אָרגאַן אַנטוויקלונג4, מיר באמערקט אַז GA סיגנאַלז זענען נידעריק אין די פלאָראַל פּרימאָרדיום (פּ) סטאַרטינג פון די P3 בינע (Fig. 4a, b), כוועראַז יונג P1 און P2 פּרימאָרדיאַמז האָבן מעסיק טעטיקייט ענלעך צו די אין די הויפט געגנט (Fig. 4a, b). העכער GA סיגנאַלינג טעטיקייט איז געווען דיטעקטאַד ביי די אָרגאַן פּרימאָרדיום באַונדריז, סטאַרטינג בייַ פּ 1 / פּ 2 (אין די זייטן פון די גרענעץ) און פּיקינג ביי פּ 4, ווי געזונט ווי אין אַלע סעלז פון די פּעריפעראַל געגנט צווישן די פּרימאָרדיאַ (פיגורע 4 אַ, ב און סופּפּלעמענטאַרי פייג 8 אַ, ב). דעם העכער גאַ סיגנאַלינג טעטיקייט איז באמערקט ניט בלויז אין די עפּידעמיס אָבער אויך אין די ל 2 און אויבערשטער ל 3 לייַערס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 8 ב). דער מוסטער פון גאַ סיגנאַלז דיטעקטאַד אין די סאַם ניצן qmRGA אויך פארבליבן אַנטשיינדזשד איבער צייַט (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 8 ק-ף, ק). כאָטש די qd17mRGA קאַנסטראַקט איז סיסטאַמאַטיקלי דאַונרעגיאַלייטיד אין די סאַם פון ט 3 געוויקסן פֿון פינף פרייַ שורות וואָס מיר קעראַקטערייזד אין דעטאַל, מיר זענען ביכולת צו פונאַנדערקלייַבן די פלורעסאַנס פּאַטערנז באקומען מיט די pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP קאַנסטראַקט (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 8g-j, ל). אין דעם קאָנטראָל שורה, בלויז מינערווערטיק ענדערונגען אין די פלורעסאַנס פאַרהעלטעניש זענען דיטעקטאַד אין די SAM, אָבער אין די SAM צענטער מיר באמערקט אַ קלאָר און אומגעריכט פאַרקלענערן אין VENUS פֿאַרבונדן מיט TagBFP. דאָס קאַנפערמז אַז די סיגנאַלינג מוסטער באמערקט דורך qmRGA ריפלעקס GA-אָפענגיק דערנידעריקונג פון mRGA-VENUS, אָבער אויך דעמאַנסטרייץ אַז qmRGA קען אָוווערעסטאַמייט GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין די מעריסטעם צענטער. אין קיצער, אונדזער רעזולטאַטן אַנטדעקן אַ GA סיגנאַלינג מוסטער וואָס בפֿרט ריפלעקס די פאַרשפּרייטונג פון פּרימאָרדיאַ. די פאַרשפּרייטונג פון די ינטער-פּרימאָרדיאַל געגנט (IPR) איז רעכט צו דער גראַדזשואַל פאַרלייגן פון הויך GA סיגנאַלינג טעטיקייט צווישן די דעוועלאָפּינג פּרימאָרדיום און די הויפט געגנט, בשעת אין דער זעלביקער צייט GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין די פּרימאָרדיום דיקריסאַז (Fig. 4c, d).
די פאַרשפּרייטונג פון GID1b און GID1c ראַסעפּטערז (זען אויבן) סאַגדזשעסץ אַז דיפערענטשאַל אויסדרוק פון GA ראַסעפּטערז העלפּס פאָרעם די מוסטער פון GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין די סאַם. מיר געחידושט צי דיפערענטשאַל אַקיומיאַליישאַן פון GA קען זיין ינוואַלווד. צו פאָרשן דעם מעגלעכקייט, מיר געוויינט די nlsGPS1 GA FRET סענסער21. געוואקסן אַקטאַוויישאַן אָפטקייַט איז געווען דיטעקטאַד אין די SAM פון nlsGPS1 באהאנדלט מיט 10 μM GA4 + 7 פֿאַר 100 מינוט (סופּפּלעמענטאַרי Fig. 9a-e), וואָס ינדיקייץ אַז nlsGPS1 ריספּאַנדז צו ענדערונגען אין GA קאַנסאַנטריישאַן אין די SAM, ווי אין ראָאָץ21. ספּיישאַל פאַרשפּרייטונג פון nlsGPS1 אַקטאַוויישאַן אָפטקייַט אנטפלעקט לעפיערעך נידעריק גאַ לעוועלס אין די ויסווייניקסט לייַערס פון די סאַם, אָבער געוויזן אַז זיי זענען עלעוואַטעד אין דעם צענטער און בייַ די געמארקן פון די סאַם (Fig. 4e און סאַפּלאַמענערי פייג. 9 אַ, C). דאָס סאַגדזשעסץ אַז GA איז אויך פונאנדערגעטיילט אין די SAM מיט אַ ספּיישאַל מוסטער פאַרגלייַכלעך צו דעם גילוי דורך qmRGA. ווי אַ קאַמפּלאַמענטשי צוגאַנג, מיר אויך באהאנדלט די SAM מיט פלורעסאַנט GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) אָדער Fl אַליין ווי אַ נעגאַטיוו קאָנטראָל. די פל סיגנאַל איז פונאנדערגעטיילט איבער די סאַם, אַרייַנגערעכנט די הויפט געגנט און פּרימאָרדיום, אָלבייט בייַ אַ נידעריקער ינטענסיטי (Fig. 4j און סאַפּלאַמענערי פייג. 10ד). אין קאַנטראַסט, אַלע דריי GA-Fl אַקיומיאַלייטיד ספּאַסיפיקלי ין די פּרימאָרדיום געמארקן און צו וועריינג דיגריז אין די רעשט פון די IPR, מיט GA7-Fl אַקיומיאַלייטיד אין די גרעסטע פעלד אין די IPR (Fig. 4 ק און סאַפּלאַמענערי פייג. 10 אַ, ב). קוואַנטיפיקאַטיאָן פון פלורעסאַנס ינטענסיטי אנטפלעקט אַז די IPR צו ניט-IPR ינטענסיטי פאַרהעלטעניש איז געווען העכער אין GA-Fl-באהאנדלט סאַם קאַמפּערד צו פל-באהאנדלט סאַם (Fig. 4ל און סאַפּלאַמענערי פייג. 10c). צוזאַמען, די רעזולטאַטן פֿאָרשלאָגן אַז GA איז פאָרשטעלן אין העכער קאַנסאַנטריישאַנז אין IPR סעלז וואָס זענען נאָענט צו די אָרגאַן גרענעץ. דאָס סאַגדזשעסץ אַז די מוסטער פון SAM GA סיגנאַלינג טעטיקייט רעזולטאַטן פֿון ביידע דיפערענטשאַל אויסדרוק פון GA ראַסעפּטערז און דיפערענטשאַל אַקיומיאַליישאַן פון GA אין IPR סעלז לעבן אָרגאַן געמארקן. אזוי, אונדזער אַנאַליסיס אנטפלעקט אַן אומגעריכט ספּאַטיאָטעמפּאָראַל מוסטער פון GA סיגנאַלינג, מיט נידעריקער טעטיקייט אין די צענטער און פּרימאָרדיום פון די SAM און העכער טעטיקייט אין די IPR אין די פּעריפעראַל געגנט.
צו פֿאַרשטיין די ראָלע פון ​​דיפערענטשאַל GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין די SAM, מיר אַנאַלייזד די קאָראַליישאַן צווישן GA סיגנאַלינג טעטיקייט, צעל יקספּאַנשאַן און צעל אָפּטייל ניצן פאַקטיש-צייט צייט-לויפן ימידזשינג פון די SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS. געגעבן די ראָלע פון ​​GA אין גראָוט רעגולירן, אַ positive קאָראַליישאַן מיט צעל יקספּאַנשאַן פּאַראַמעטערס איז געווען דערוואַרט. דעריבער, מיר ערשטער קאַמפּערד GA סיגנאַלינג טעטיקייט מאַפּס מיט מאַפּס פון צעל ייבערפלאַך גראָוט קורס (ווי אַ פּראַקסי פֿאַר די שטאַרקייט פון צעל יקספּאַנשאַן פֿאַר אַ געגעבן צעל און פֿאַר טאָכטער סעלז ביי דיטיילד) און מיט מאַפּס פון גראָוט אַניזאָטראָפּי, וואָס מעסטן די דירעקטיאָנאַליטי פון צעל יקספּאַנשאַן (אויך געניצט דאָ פֿאַר אַ געגעבן צעל און פֿאַר טאָכטער סעלז ביי דיטיילד; Fig. 5a,b, זען מעטהאָדס און סאַפּלאַמענערי מעטהאָדס). אונדזער מאַפּס פון סאַם צעל ייבערפלאַך גראָוט קורס זענען קאָנסיסטענט מיט פרייַערדיק אַבזערוויישאַנז 38, 39, מיט מינימאַל גראָוט ראַטעס ביי די גרענעץ און מאַקסימום וווּקס ראַטעס אין דעוועלאָפּינג בלומען (Fig. 5 אַ). הויפּט קאָמפּאָנענט אַנאַליסיס (פּקאַ) געוויזן אַז GA סיגנאַלינג טעטיקייט איז נעגאַטיוולי קאָראַלייטאַד מיט צעל ייבערפלאַך גראָוט ינטענסיטי (פיגורע 5c). מיר אויך געוויזן אַז די הויפּט אַקסעס פון ווערייישאַן, אַרייַנגערעכנט GA סיגנאַלינג אַרייַנשרייַב און גראָוט ינטענסיטי, זענען אָרטאָגאָנאַל צו דער ריכטונג באשלאסן דורך הויך CLV3 אויסדרוק, קאַנפערמינג די יקסקלוזשאַן פון סעלז פון די SAM צענטער אין די רוען אַנאַליזעס. ספּעאַרמאַן קאָראַליישאַן אַנאַליסיס באשטעטיקט די פּקאַ רעזולטאַטן (פיגורע 5 ד), וואָס ינדיקייץ אַז העכער GA סיגנאַלז אין די IPR האָבן נישט געפֿירט צו העכער צעל יקספּאַנשאַן. אָבער, קאָראַליישאַן אַנאַליסיס אנטפלעקט אַ קליין positive קאָראַליישאַן צווישן GA סיגנאַלינג טעטיקייט און וווּקס אַניסאָטראָפּי (פיגורע 5c, d), סאַגדזשעסטינג אַז העכער GA סיגנאַלינג אין די IPR ינפלואַנסיז די ריכטונג פון צעל גראָוט און עפשער די שטעלע פון ​​​​די צעל אָפּטייל פלאַך.
אַ, ב היץ מאַפּס פון דורכשניטלעך ייבערפלאַך גראָוט (אַ) און גראָוט אַניזאָטראָפּי (ב) אין SAM אַוורידזשד איבער זיבן פרייַ געוויקסן (געוויינט ווי פּראַקסיז פֿאַר די שטאַרקייַט און ריכטונג פון צעל יקספּאַנשאַן, ריספּעקטיוולי). c פּקאַ אַנאַליסיס אַרייַנגערעכנט די פאלגענדע וועריאַבאַלז: GA סיגנאַל, ייבערפלאַך גראָוט ינטענסיטי, ייבערפלאַך גראָוט אַניזאָטראָפּי און CLV3 אויסדרוק. פּקאַ קאָמפּאָנענט 1 איז געווען דער הויפּט נעגאַטיוולי קאָראַלייטאַד מיט ייבערפלאַך גראָוט ינטענסיטי און דורכויס קאָראַלייטאַד מיט GA סיגנאַל. פּקאַ קאָמפּאָנענט 2 איז דער הויפּט דורכויס קאָראַלייטאַד מיט ייבערפלאַך גראָוט אַניזאָטראָפּי און נעגאַטיוולי קאָראַלייטאַד מיט CLV3 אויסדרוק. פּערסענטידזשיז פאָרשטעלן די ווערייישאַן דערקלערט דורך יעדער קאָמפּאָנענט. ד ספּעאַרמאַן קאָראַליישאַן אַנאַליסיס צווישן GA סיגנאַל, ייבערפלאַך גראָוט ינטענסיטי און ייבערפלאַך גראָוט אַניזאָטראָפּי אין די געוועב וואָג עקסקלודינג CZ. די נומער אויף די רעכט איז די Spearman rho ווערט צווישן צוויי וועריאַבאַלז. אַסטעריסקס אָנווייַזן קאַסעס ווען די קאָראַליישאַן / נעגאַטיוו קאָראַליישאַן איז העכסט באַטייַטיק. e 3D וויזשוואַלאַזיישאַן פון Col-0 SAM L1 סעלז דורך קאַנפאָקאַל מיקראָסקאָפּי. ניו צעל ווענט געשאפן אין די סאַם (אָבער נישט די פּרימאָרדיום) אין 10 ה זענען בונט לויט זייער ווינקל וואַלועס. די קאָליר באַר איז געוויזן אין דער נידעריקער רעכט ווינקל. די ינסעט ווייַזן די קאָראַספּאַנדינג 3 ד בילד אין 0 שעה. דער עקספּערימענט איז געווען ריפּיטיד צוויי מאָל מיט ענלעך רעזולטאַטן. f באָקס פּלאַץ ווייַז צעל אָפּטייל ראַטעס אין IPR און ניט-IPR Col-0 SAM (n = 10 פרייַ געוויקסן). די צענטער שורה ווייזט די מידיאַן, און די קעסטל באַונדריז אָנווייַזן די 25 און 75 פּראָצענט. וואָנצעס אָנווייַזן די מינימום און מאַקסימום וואַלועס באשלאסן מיט R ווייכווארג. P וואַלועס זענען באקומען מיט די צוויי-טיילד ה-טעסט פון Welch. g, h סכעמאַטיש דיאַגראַמע ווייזונג (ג) ווי צו מעסטן די ווינקל פון די נייַ צעל וואַנט (מאַגענטאַ) מיט רעספּעקט צו די ריידיאַל ריכטונג פון די צענטער פון די SAM (ווייַס דאַטיד שורה) (בלויז אַקוטע ווינקל וואַלועס, ד"ה 0-90 °, זענען באַטראַכט), און (ה) די אַרומיק / לאַטעראַל און ריידיאַל אינסטרוקציעס אין די מעריסטעם. איך אָפטקייַט כיסטאַגראַמז פון אָריענטירונג פון צעל דיוויזשאַן פלאַך איבער די SAM (פינצטער בלוי), IPR (מיטל בלוי), און ניט-IPR (ליכט בלוי), ריספּעקטיוולי. פּ וואַלועס זענען באקומען דורך אַ צוויי-טיילד קאָלמאָגאָראָוו-סמירנאָוו פּרובירן. דער עקספּערימענט איז געווען ריפּיטיד צוויי מאָל מיט ענלעך רעזולטאַטן. דזש אָפטקייַט כיסטאַגראַמז פון צעל דיוויזשאַן פלאַך אָריענטירונג פון די IPR אַרום P3 (ליכט גרין), P4 (מיטל גרין), און P5 (פינצטער גרין), ריספּעקטיוולי. פּ וואַלועס זענען באקומען דורך אַ צוויי-טיילד קאָלמאָגאָראָוו-סמירנאָוו פּרובירן. דער עקספּערימענט איז געווען ריפּיטיד צוויי מאָל מיט ענלעך רעזולטאַטן.
דעריבער, מיר ווייַטער ינוועסטאַגייטאַד די קאָראַליישאַן צווישן GA סיגנאַלינג און צעל אָפּטייל טעטיקייט דורך ידענטיפיינג ניי געשאפן צעל ווענט בעשאַס די אַסיי (Fig. 5e). דעם צוגאַנג ערלויבט אונדז צו מעסטן די אָפטקייַט און ריכטונג פון צעל אָפּטייל. סאַפּרייזינגלי, מיר געפֿונען אַז די אָפטקייַט פון צעל דיוויזשאַנז אין די IPR און די רעשט פון די SAM (ניט-IPR, Fig. 5f) איז געווען ענלעך, וואָס ינדיקייץ אַז דיפעראַנסיז אין GA סיגנאַלינג צווישן IPR און ניט-IPR סעלז טאָן ניט באטייטיק ווירקן צעל אָפּטייל. דאָס, און די positive קאָראַליישאַן צווישן GA סיגנאַלינג און וווּקס אַניסאָטראָפּי, פּראַמפּטיד אונדז צו באַטראַכטן צי GA סיגנאַלינג טעטיקייט קען השפּעה די אָריענטירונג פון די צעל אָפּטייל פלאַך. מיר געמאסטן די אָריענטירונג פון די נייַ צעל וואַנט ווי אַן אַקוטע ווינקל קאָרעוו צו די ריידיאַל אַקס קאַנעקטינג די מעריסטעם צענטער און די צענטער פון די נייַ צעל וואַנט (Fig. 5e-i) און באמערקט אַ קלאָר טענדענץ פֿאַר סעלז צו צעטיילן אין אַנגלעס נאָענט צו 90 ° קאָרעוו צו די ריידיאַל אַקס, מיט די העכסטן פריקוואַנסיז באמערקט בייַ 8 ° 20. (22.62%) (Fig. 5e, I), קאָראַספּאַנדינג צו צעל דיוויזשאַנז אין די אַרומיק / טראַנזווערס ריכטונג (Fig. 5 ה). צו ונטערזוכן די צושטייַער פון GA סיגנאַלינג צו דעם צעל אָפּטייל נאַטור, מיר אַנאַלייזד צעל אָפּטייל פּאַראַמעטערס אין די IPR און ניט-IPR סעפּעראַטלי (Fig. 5i). מיר באמערקט אַז די דיטיילד ווינקל פאַרשפּרייטונג אין IPR סעלז איז אַנדערש פון אַז אין ניט-IPR סעלז אָדער אין סעלז אין די גאנצע SAM, מיט IPR סעלז יגזיביטינג אַ העכער פּראָפּאָרציע פון ​​לאַטעראַל / קייַלעכיק צעל דיוויזשאַנז, הייסט 70-80 ° און 80-90 ° (33.86% און 30.71%, ריספּעקטיוולי 5, קאָראַספּאַנדינג פּראַפּאָרשאַנז). אזוי, אונדזער אַבזערוויישאַנז אנטפלעקט אַ פאַרבאַנד צווישן הויך גאַ סיגנאַלינג און אַ צעל אָפּטייל פלאַך אָריענטירונג נאָענט צו די סערקאַמפערענטשאַל ריכטונג, ענלעך צו די קאָראַליישאַן צווישן GA סיגנאַלינג טעטיקייט און וווּקס אַניסאָטראָפּי (Fig. 5c, d). צו ווייַטער פאַרלייגן די ספּיישאַל קאַנסערוויישאַן פון דעם פאַרבאַנד, מיר געמאסטן די אָפּטייל פלאַך אָריענטירונג אין IPR סעלז אַרומיק די פּרימאָרדיום סטאַרטינג פון P3, זינט די העכסטן GA סיגנאַלינג טעטיקייט איז געווען דיטעקטאַד אין דעם געגנט סטאַרטינג פון P4 (Fig. 4). די אָפּטייל אַנגלעס פון די IPR אַרום P3 און P4 געוויזן קיין סטאַטיסטיש באַטייַטיק דיפעראַנסיז, כאָטש אַ געוואקסן אָפטקייַט פון לאַטעראַל צעל דיוויזשאַנז איז באמערקט אין די IPR אַרום P4 (Fig. 5j). אָבער, אין די IPR סעלז אַרום P5, די חילוק אין די אָריענטירונג פון די צעל אָפּטייל פלאַך געווארן סטאַטיסטיש באַטייַטיק, מיט אַ שאַרף פאַרגרעסערן אין די אָפטקייַט פון טראַנזווערס צעל דיוויזשאַנז (Fig. 5j). צוזאַמען, די רעזולטאַטן פֿאָרשלאָגן אַז GA סיגנאַלינג קענען קאָנטראָלירן די אָריענטירונג פון צעל דיוויזשאַנז אין די SAM, וואָס איז קאָנסיסטענט מיט פרייַערדיק ריפּאָרץ40,41 אַז הויך GA סיגנאַלינג קענען ינדוסירן לאַטעראַל אָריענטירונג פון צעל דיוויזשאַנז אין די IPR.
עס איז פּרעדיקטעד אַז סעלז אין די IPR וועט נישט זיין ינקאָרפּערייטיד אין פּרימאָרדיאַ אָבער גאַנץ אין ינטערנאָדעס 2,42,43. די טראַנזווערס אָריענטירונג פון צעל דיוויזשאַנז אין די IPR קען רעזולטאַט אין די טיפּיש אָרגאַניזאַציע פון ​​פּאַראַלעל לאַנדזשאַטודאַנאַל ראָוז פון עפּאַדערמאַל סעלז אין ינטערנאָדעס. אונדזער אַבזערוויישאַנז דיסקרייבד אויבן פֿאָרשלאָגן אַז GA סיגנאַלינג מיסטאָמע פיעסעס אַ ראָלע אין דעם פּראָצעס דורך רעגיאַלייטינג די ריכטונג פון צעל אָפּטייל.
אָנווער פון פונקציע פון ​​​​עטלעכע DELLA גענעס רעזולטאטן אין אַ קאַנסטאַטוטיוו GA ענטפער, און דעלאַ מיוטאַנץ קענען זיין געוויינט צו פּרובירן דעם כייפּאַטאַסאַס44. מיר ערשטער אַנאַלייזד די אויסדרוק פּאַטערנז פון פינף DELLA גענעס אין די SAM. טראַנסקריפּציע פוסיאָן פון די GUS ליניע45 אנטפלעקט אַז GAI, RGA, RGL1 און RGL2 (אין אַ פיל ווייניקער מאָס) זענען אויסגעדריקט אין די סאַם (סאַפּלאַמענערי פייג. 11 אַ-ד). אין סיטו כייברידיזיישאַן ווייַטער דעמאַנסטרייטיד אַז גאַי מרנאַ אַקיומיאַלייץ ספּאַסיפיקלי אין פּרימאָרדיאַ און דעוועלאָפּינג בלומען (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 11 ע). רגל1 און רגל3 מרנאַ זענען דיטעקטאַד איבער די סאַם כופּע און אין עלטערע בלומען, כוועראַז רגל2 מרנאַ איז געווען מער שעפעדיק אין די גרענעץ געגנט (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 11ף-ה). קאָנפאָקאַל ימאַגינג פון pRGL3 :: RGL3-GFP SAM באשטעטיקט די אויסדרוק באמערקט דורך אין סיטו כייברידיזיישאַן און געוויזן אַז RGL3 פּראָטעין אַקיומיאַלייץ אין די הויפט טייל פון די סאַם (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 11י). ניצן די פּרגאַ :: גפפּ-רגאַ שורה, מיר אויך געפונען אַז רגאַ פּראָטעין אַקיומיאַלייץ אין די סאַם, אָבער זייַן זעט דיקריסאַז בייַ די גרענעץ סטאַרטינג פון פּ4 (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 11דזש). נאָוטאַבלי, די אויסדרוק פּאַטערנז פון RGL3 און RGA זענען קאָנסיסטענט מיט העכער GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין די IPR, ווי דיטעקטאַד דורך qmRGA (Fig. 4). דערצו, די דאַטן אָנווייַזן אַז אַלע DELLAs זענען אויסגעדריקט אין די SAM און אַז זייער אויסדרוק קאַלעקטיוולי ספּאַנס די גאנצע SAM.
מיר ווייַטער אַנאַלייזד די צעל אָפּטייל פּאַראַמעטערס אין די ווילד-טיפּ סאַם (לער, קאָנטראָל) און די גאַי-ט6 רגאַ-ט2 רגל1-1 רגל2-1 רגל3-4 דעלאַ קווינטופּלע (גלאבאלע) מיוטאַנץ (פיגורע 6אַ, ב). ינטערעסטינגלי, מיר באמערקט אַ סטאַטיסטיש באַטייַטיק יבעררוק אין די פאַרשפּרייטונג פון צעל אָפּטייל ווינקל פריקוואַנסיז אין די דעלאַ גלאבאלע מוטאַנט סאַם קאַמפּערד מיט די ווילד טיפּ (Fig. 6c). דער ענדערונג אין די דעלאַ גלאבאלע מוטאַנט איז געווען רעכט צו אַ פאַרגרעסערן אין די אָפטקייַט פון 80-90 ° אַנגלעס (34.71% ווס. 24.55%) און, צו אַ ווייניקער מאָס, 70-80 ° אַנגלעס (23.78% ווס. 20.18%), ד"ה קאָראַספּאַנדינג צו טראַנזווערס צעל דיוויזשאַנז (Fig.6). די אָפטקייַט פון ניט-טראַנזווערס דיוויזשאַנז (0-60 °) איז אויך נידעריקער אין די דעלאַ גלאבאלע מוטאַנט (Fig. 6c). די אָפטקייַט פון טראַנזווערס צעל דיוויזשאַנז איז באטייטיק געוואקסן אין די סאַם פון די דעלאַ גלאבאלע מוטאַנט (Fig. 6b). די אָפטקייַט פון טראַנזווערס צעל דיוויזשאַנז אין די IPR איז אויך העכער אין די דעלאַ גלאבאלע מוטאַנט קאַמפּערד צו די ווילד טיפּ (Fig. 6 ד). אַרויס די IPR געגנט, די ווילד טיפּ האט אַ מער מונדיר פאַרשפּרייטונג פון צעל אָפּטייל אַנגלעס, כוועראַז די דעלאַ גלאבאלע מוטאַנט בילכער טאַנגענטיאַל דיוויזשאַנז ווי די IPR (Fig. 6e). מיר אויך קוואַנטאַפייד די אָריענטירונג פון צעל דיוויזשאַנז אין די סאַם פון גאַ 2 אָקסידאַסע (גאַ 2 אָקס) קווינטופּלע מיוטאַנץ (גאַ 2 אָקס 1-1, גאַ 2 אָקס 2-1, גאַ 2 אָקס 3-1, גאַ 2 אָקס 4-1 און גאַ 2 אָקס 6-2), אַ גאַ-ינאַקטיוו מיוטאַנט הינטערגרונט אין וואָס גאַ אַקיומיאַלייץ. קאָנסיסטענט מיט די פאַרגרעסערן אין GA לעוועלס, די SAM פון די קווינטופּלע גאַ2אָקס מוטאַנט ינפלאָרעססענסע איז געווען גרעסער ווי אַז פון קאָל-0 (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 12אַ, ב), און קאַמפּערד מיט קאָל-0, די קווינטופּלע גאַ2אָקס סאַם געוויזן אַ דיסטינגקטלי אַנדערש פאַרשפּרייטונג פון צעל דיוויזשאַן אַנגלעס, מיט די 900 ווינקל פון די טאַנגענטיאַל אָפטקייַט צו ווידער 500. דיוויזשאַנז (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 12a-c). אזוי, מיר ווייַזן אַז קאַנסטאַטוטיוו אַקטאַוויישאַן פון GA סיגנאַלינג און GA אַקיומיאַליישאַן ינדוסירן לאַטעראַל צעל דיוויזשאַנז אין די IPR און די רעשט פון די SAM.
אַ, ב 3 ד וויזשוואַלאַזיישאַן פון די L1 שיכטע פון ​​פּי-סטיינד לער (אַ) און גלאבאלע דעלאַ מוטאַנט (ב) SAM ניצן קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּי. ניו צעל ווענט געשאפן אין די SAM (אָבער נישט די פּרימאָרדיום) איבער אַ 10-ה צייט זענען געוויזן און בונט לויט זייער ווינקל וואַלועס. די ינסעט ווייזט די SAM ביי 0 ה. די קאָליר באַר איז געוויזן אין דער נידעריקער רעכט ווינקל. די פייַל אין (ב) ווייזט צו אַ בייַשפּיל פון אַליינד צעל טעקעס אין די גלאבאלע דעלאַ מוטאַנט. דער עקספּערימענט איז געווען ריפּיטיד צוויי מאָל מיט ענלעך רעזולטאַטן. ce פאַרגלייַך פון די אָפטקייַט פאַרשפּרייטונג פון צעל אָפּטייל פלאַך אָריענטיישאַנז אין די גאַנץ סאַם (ד), IPR (E), און ניט-IPR (F) צווישן Ler און גלאבאלע דעלאַ. פּ וואַלועס זענען באקומען מיט אַ צוויי-טיילד קאָלמאָגאָראָוו-סמירנאָוו פּרובירן. f, g 3D וויזשוואַלאַזיישאַן פון קאָנפאָקאַל בילדער פון פּי-סטיינד סאַם פון קאָל-0 (איך) און pCUC2 :: גאַי-1-ווענוס (דזש) טראַנסגעניק געוויקסן. פּאַנאַלז (אַ, ב) ווייַזן נייַ צעל ווענט (אָבער נישט פּרימאָרדיאַ) געשאפן אין די סאַם ין 10 ה. דער עקספּערימענט איז געווען ריפּיטיד צוויי מאָל מיט ענלעך רעזולטאַטן. h–j פאַרגלייַך פון די אָפטקייַט פאַרשפּרייטונג פון צעל אָפּטייל פלאַך אָריענטיישאַנז ליגן אין די גאנצע SAM (ה), IPR (i) און ניט-IPR (j) צווישן Col-0 און pCUC2 :: גאַי-1-ווענוס געוויקסן. פּ וואַלועס זענען באקומען מיט אַ צוויי-טיילד קאָלמאָגאָראָוו-סמירנאָוו פּרובירן.
דערנאָך מיר טעסטעד די ווירקונג פון ינכיבאַטינג GA סיגנאַלינג ספּאַסיפיקלי אין די IPR. צו דעם סוף, מיר געוויינט די קאָטילעדאָן גלעזל 2 (CUC2) פּראָמאָטער צו פירן אויסדרוק פון אַ דאָמינאַנט נעגאַטיוו גאַי-1 פּראָטעין פיוזד צו VENUS (אין די pCUC2 :: גאַי-1-ווענוס שורה). אין די ווילד-טיפּ SAM, די CUC2 פּראָמאָטער דרייווז אויסדרוק פון רובֿ IPRs אין די SAM, אַרייַנגערעכנט גרענעץ סעלז, פֿון P4 אַנווערדז, און ענלעך ספּעציפיש אויסדרוק איז באמערקט אין pCUC2 :: gai-1-VENUS געוויקסן (זען ווייטער). די פאַרשפּרייטונג פון צעל אָפּטייל אַנגלעס אַריבער די SAM אָדער IPR פון pCUC2 :: גאַי-1-ווענוס געוויקסן איז נישט באטייטיק אַנדערש פון די ווילד טיפּ, כאָטש אַניקספּעקטידלי מיר געפונען אַז סעלז אָן אַן IPR אין די געוויקסן צעטיילט אין אַ העכער אָפטקייַט פון 80-90 ° (Fig. 6f-j).
עס איז געווען סאַגדזשעסטיד אַז די ריכטונג פון צעל אָפּטייל דעפּענדס אויף די דזשיאַמאַטרי פון די SAM, ספּעציעל די טענסאַל דרוק דזשענערייטאַד דורך די געוועב קערוואַטשער46. מיר דעריבער געפרעגט צי די פאָרעם פון די סאַם איז אָלטערד אין די דעלאַ גלאבאלע מוטאַנט און pCUC2 :: גאַי-1-ווענוס געוויקסן. ווי פריער געמאלדן 12, די גרייס פון די דעלאַ גלאבאלע מוטאַנט סאַם איז געווען גרעסער ווי די ווילד טיפּ (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 13 אַ, ב, ד). אין סיטו כייברידיזיישאַן פון CLV3 און STM RNA באשטעטיקט די מעריסטעם יקספּאַנשאַן אין דעלאַ מיוטאַנץ און ווייַטער געוויזן די לאַטעראַל יקספּאַנשאַן פון די סטעם צעל נישע (סופּפּלעמענטאַרי Fig. 13e, F, H, I). אָבער, די סאַם קערוואַטשער איז געווען ענלעך אין ביידע גענאָטיפּעס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 13 ק, עם, n, פּ). מיר באמערקט אַ ענלעך פאַרגרעסערן אין גרייס אין די גאַי-ט6 רגאַ-ט2 רגל1-1 רגל2-1 דעלאַ פירפאַכיק מוטאַנט אָן אַ ענדערונג אין קערוואַטשער קאַמפּערד מיט די ווילד טיפּ (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 13ק, ד, ג, דזש, ל, אָ, פּ). די אָפטקייַט פון צעל אָפּטייל אָריענטירונג איז אויך אַפעקטאַד אין די דעלאַ פירפאַכיק מוטאַנט, אָבער צו אַ ווייניקער מאָס ווי אין די דעלאַ מאַנאַליטיק מוטאַנט (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 12ד-ף). די דאָוסאַדזש ווירקונג, צוזאַמען מיט די פעלן פון אַ ווירקונג אויף קערוואַטשער, סאַגדזשעסץ אַז ריזידזשואַל RGL3 טעטיקייט אין די דעלאַ פירפאַכיק מוטאַנט לימאַץ ענדערונגען אין צעל אָפּטייל אָריענטירונג געפֿירט דורך אָנווער פון DELLA טעטיקייט און אַז ענדערונגען אין לאַטעראַל צעל דיוויזשאַנז פאַלן אין ענטפער צו ענדערונגען אין GA סיגנאַלינג טעטיקייט אלא ווי ענדערונגען אין SAM דזשיאַמאַטרי. ווי דיסקרייבד אויבן, די CUC2 פּראָמאָטער דרייווז IPR אויסדרוק אין די סאַם סטאַרטינג בייַ פּ4 (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 14 אַ, ב), און אין קאַנטראַסט, די pCUC2 :: גאַי-1-ווענוס סאַם האט אַ רידוסט גרייס אָבער העכער קערוואַטשער (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 14 ק-ה). די ענדערונג אין פּCUC2 :: גאַי-1-ווענוס סאַם מאָרפאָלאָגי קען רעזולטאַט אין אַ אַנדערש פאַרשפּרייטונג פון מעטשאַניקאַל סטרעסיז קאַמפּערד מיט די ווילד טיפּ, אין וואָס הויך אַרומנעם סטרעסאַז אָנהייבן אין אַ קירצער ווייַטקייט פון די סאַם צענטער47. אַלטערנאַטיוועלי, די ענדערונגען אין pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM מאָרפאָלאָגי קען רעזולטאַט פון ענדערונגען אין רעגיאָנאַל מעטשאַניקאַל פּראָפּערטיעס ינדוסט דורך טראַנסגענע עקספּרעססיאָן48. אין ביידע קאַסעס, דאָס קען טייל אָפסעט די יפעקץ פון ענדערונגען אין GA סיגנאַלינג דורך ינקריסינג די ליקעליהאָאָד אַז סעלז וועט טיילן זיך אין די אַרומיק / טראַנזווערס אָריענטירונג, וואָס דערקלערט אונדזער אַבזערוויישאַנז.
צוזאַמען, אונדזער דאַטן באַשטעטיקן אַז העכער GA סיגנאַלינג פיעסעס אַן אַקטיוו ראָלע אין די לאַטעראַל אָריענטירונג פון די צעל אָפּטייל פלאַך אין די IPR. זיי אויך ווייַזן אַז מעריסטעם קערוואַטשער אויך ינפלואַנסיז די אָריענטירונג פון די צעל אָפּטייל פלאַך אין די IPR.
די טראַנזווערס אָריענטירונג פון די אָפּטייל פלאַך אין די IPR, רעכט צו דער הויך GA סיגנאַלינג טעטיקייט, סאַגדזשעסץ אַז GA פאַר-אָרגאַניזירט אַ ריידיאַל צעל טעקע אין די עפּידעמיס אין די SAM צו דעפינירן די סעליאַלער אָרגאַניזאַציע וואָס וועט שפּעטער זיין געפֿונען אין די עפּאַדערמאַל ינטערנאָדע. טאקע, אַזאַ צעל טעקעס זענען אָפט קענטיק אין סאַם בילדער פון דעלאַ גלאבאלע מיוטאַנץ (Fig. 6b). אַזוי, צו ויספאָרשן די אַנטוויקלונג פונקציע פון ​​​​די ספּיישאַל מוסטער פון GA סיגנאַלינג אין די SAM, מיר געוויינט צייט-לויפן ימידזשינג צו אַנאַלייז די ספּיישאַל אָרגאַניזאַציע פון ​​סעלז אין די IPR אין ווילד-טיפּ (Ler און Col-0), דעלאַ גלאבאלע מיוטאַנץ און pCUC2 :: GAI-1-VENUS טראַנסגעניק געוויקסן.
מיר געפונען אַז qmRGA האט געוויזן אַז GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין די IPR געוואקסן פֿון P1 / P2 און שפּיץ ביי P4, און דעם מוסטער איז פארבליבן קעסיידערדיק איבער צייַט (Fig. 4a-f און סאַפּלאַמענערי פייג. 8c-f, ק). צו פונאַנדערקלייַבן די ספּיישאַל אָרגאַניזאַציע פון ​​סעלז אין די IPR מיט ינקריסינג GA סיגנאַל, מיר לייבאַלד Ler IPR סעלז אויבן און צו די זייטן פון P4 לויט זייער אַנטוויקלונג גורל אַנאַלייזד 34 שעה נאָך ערשטער אָבסערוואַציע, ד"ה, מער ווי צוויי פּלאַסטיד צייט, אַלאַוינג אונדז צו נאָכפאָלגן IPR סעלז בעשאַס פּרימאָרדיום אַנטוויקלונג פון P1 / P2 צו P4. מיר געוויינט דריי פאַרשידענע פארבן: געל פֿאַר די סעלז וואָס זענען ינאַגרייטיד אין די פּרימאָרדיום לעבן פּ4, גרין פֿאַר די וואָס זענען געווען אין די IPR, און לילאַ פֿאַר די וואָס האָבן אָנטייל גענומען אין ביידע פּראַסעסאַז (פיגורע 7 אַ-C). אין ט0 (0 ה), 1-2 לייַערס פון IPR סעלז זענען קענטיק אין פראָנט פון פּ4 (Fig. 7 אַ). ווי דערוואַרט, ווען די סעלז צעטיילט, זיי האבן דאָס דער הויפּט דורך די טראַנזווערס אָפּטייל פלאַך (פיג. 7 אַ-C). ענלעכע רעזולטאַטן זענען באקומען מיט Col-0 SAM (פאָוקיסינג אויף P3, וועמענס גרענעץ פאָולדז סימאַלערלי צו P4 אין Ler), כאָטש אין דעם גענאָטיפּע די פאַרלייגן געשאפן אין די פלאָראַל גרענעץ פארבארגן די IPR סעלז מער געשווינד (Fig. 7g-i). אזוי, די אָפּטייל מוסטער פון IPR סעלז פאַר-אָרגאַנייזיז די סעלז אין ריידיאַל ראָוז, ווי אין ינטערנאָדעס. די אָרגאַניזאַציע פון ​​ריידיאַל ראָוז און די לאָוקאַלאַזיישאַן פון IPR סעלז צווישן סאַקסעסיוו אָרגאַנס פֿאָרשלאָגן אַז די סעלז זענען ינטערנאָדאַל פּראָגעניטאָרס.
דאָ, מיר דעוועלאָפּעד אַ פאַרהעלטעניש GA סיגנאַלינג ביאָסענסאָר, qmRGA, וואָס אַלאַוז קוואַנטיטאַטיווע מאַפּינג פון GA סיגנאַלינג טעטיקייט ריזאַלטינג פון קאַמביינד GA און GA רעסעפּטאָר קאַנסאַנטריישאַנז בשעת מינאַמייזינג ינטערפיראַנס מיט ענדאָגענאָוס סיגנאַלינג פּאַטווייז, דערמיט צושטעלן אינפֿאָרמאַציע אויף GA פונקציע אויף די סעליאַלער מדרגה. צו דעם סוף, מיר קאַנסטראַקטאַד אַ מאַדאַפייד DELLA פּראָטעין, mRGA, וואָס האט פאַרלאָרן די פיייקייט צו בינדן DELLA ינטעראַקשאַן פּאַרטנערס אָבער בלייבט שפּירעוודיק צו GA-ינדוסט פּראָטעאָליסיס. qmRGA ריספּאַנדז צו עקסאָגענאָוס און ענדאָגענאָוס ענדערונגען אין GA לעוועלס, און זיין דינאַמיש סענסינג פּראָפּערטיעס געבן אַסעסמאַנט פון ספּאַטיאָטעמפּאָראַל ענדערונגען אין GA סיגנאַלינג טעטיקייט בעשאַס אַנטוויקלונג. qmRGA איז אויך אַ זייער פלעקסאַבאַל געצייַג ווייַל עס קענען זיין צוגעפאסט צו פאַרשידענע געוועבן דורך טשאַנגינג די פּראָמאָטער געניצט פֿאַר זיין אויסדרוק (אויב נייטיק), און ווייַל פון די קאַנסערווד נאַטור פון די GA סיגנאַלינג פּאַטוויי און די PFYRE מאָטיף אַריבער אַנגיאָספּערמס, עס איז מסתּמא טראַנספעראַבאַל צו אנדערע מינים 22. קאָנסיסטענט מיט דעם, אַן עקוויוואַלענט מיוטיישאַן אין די רייַז SLR1 DELLA פּראָטעין (HYY497AAA) איז אויך געוויזן צו פאַרשטיקן די וווּקס רעפּרעססאָר טעטיקייט פון SLR1 בשעת בלויז אַ ביסל רידוסינג זייַן GA-מעדיאַטעד דערנידעריקונג, ענלעך צו mRGA23. נאָוטאַבאַל, לעצטע שטודיום אין אַראַבידאָפּסיס געוויזן אַז אַ איין אַמינאָ זויער מיוטיישאַן אין די PFYRE פעלד (S474L) אָלטערד די טראַנסקריפּציע טעטיקייט פון RGA אָן אַפעקטינג זייַן פיייקייט צו ינטעראַקט מיט טראַנסקריפּציע פאַקטאָר פּאַרטנערס50. כאָטש די מיוטיישאַן איז זייער נאָענט צו די 3 אַמינאָ זויער סאַבסטיטיושאַנז אין mRGA, אונדזער שטודיום ווייַזן אַז די צוויי מיוטיישאַנז טוישן די פאַרשידענע קעראַקטעריסטיקס פון DELLA. כאָטש רובֿ טראַנסקריפּציע פאַקטאָר פּאַרטנערס בינדן צו די LHR1 און SAW דאָומיינז פון DELLA26,51, עטלעכע קאַנסערווד אַמינאָ אַסאַדז אין די PFYRE פעלד קען העלפֿן סטייבאַלייז די ינטעראַקשאַנז.
ינטערנאָדע אַנטוויקלונג איז אַ שליסל טרייט אין פאַבריק אַרקאַטעקטשער און טראָגן פֿאַרבעסערונג. qmRGA אנטפלעקט העכער GA סיגנאַלינג טעטיקייט אין IPR ינטערנאָדע פּראָגעניטאָר סעלז. דורך קאַמביינינג קוואַנטיטאַטיווע ימאַגינג און דזשאַנעטיקס, מיר געוויזן אַז GA סיגנאַלינג פּאַטערנז סופּעראַמפּאָוז קייַלעכיק / טראַנזווערס צעל דיוויזשאַן פּליינז אין די SAM עפּידעמיס, פאָרעם די צעל אָפּטייל אָרגאַניזאַציע פארלאנגט פֿאַר ינטערנאָדע אַנטוויקלונג. עטלעכע רעגיאַלייטערז פון צעל אָפּטייל פלאַך אָריענטירונג האָבן שוין יידענאַפייד בעשאַס אַנטוויקלונג52,53. אונדזער אַרבעט גיט אַ קלאָר בייַשפּיל פון ווי GA סיגנאַלינג טעטיקייט רעגיאַלייץ דעם סעליאַלער פּאַראַמעטער. DELLA קענען ינטעראַקט מיט פּרעפאָלדינג פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז41, אַזוי GA סיגנאַלינג קען רעגולירן די אָריענטירונג פון צעל דיוויזשאַן פלאַך דורך גלייַך ינפלואַנסינג די קאָרטיקאַל מיקראָטובולע ​​אָריענטירונג40,41,54,55. מיר אַניקספּעקטידלי געוויזן אַז אין SAM, די קאָראַלייט פון העכער GA סיגנאַלינג טעטיקייט איז נישט צעל ילאָנגגיישאַן אָדער אָפּטייל, אָבער בלויז גראָוט אַניסאָטראָפּי, וואָס איז קאָנסיסטענט מיט אַ דירעקט ווירקונג פון GA אויף דער ריכטונג פון צעל אָפּטייל אין די IPR. אָבער, מיר קענען נישט ויסשליסן אַז די ווירקונג קען אויך זיין ומדירעקט, פֿאַר בייַשפּיל מידיייטיד דורך GA-ינדוסט צעל וואַנט סאָפנינג 56. ענדערונגען אין צעל וואַנט פּראָפּערטיעס ינדוסירן מעטשאַניקאַל דרוק57,58, וואָס קענען אויך השפּעה די אָריענטירונג פון די צעל אָפּטייל פלאַך דורך אַפעקטינג די אָריענטירונג פון קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס39,46,59. די קאַמביינד יפעקץ פון GA-ינדוסט מעטשאַניקאַל דרוק און דירעקט רעגולירן פון מיקראָטובולע ​​אָריענטירונג דורך GA קען זיין ינוואַלווד אין דזשענערייטינג אַ ספּעציפיש מוסטער פון צעל אָפּטייל אָריענטירונג אין די IPR צו דעפינירן ינטערנאָדעס, און ווייַטער שטודיום זענען דארף צו פּרובירן דעם געדאַנק. ענלעך, פריערדיקע שטודיום האָבן כיילייטיד די וויכטיקייט פון די DELLA-ינטעראַקטינג פּראָטעינס TCP14 און 15 אין די קאָנטראָל פון ינטערנאָדע פאָרמירונג60,61 און די סיבות קען פאַרמיטלען די קאַמף פון GA צוזאַמען מיט BREVIPEDICELLUS (BP) און PENNYWISE (PNY), וואָס רעגולירן ינטערנאָדע אַנטוויקלונג און האָבן געוויזן צו השפּעה GA סיגנאַלינג2. געגעבן אַז DELLAs ינטעראַקט מיט בראַססינאָסטעראָיד, עטאַלין, דזשאַסמאָניק זויער און אַבססיסיק זויער (אַבאַ) סיגנאַלינג פּאַטווייז63,64 און אַז די כאָרמאָונז קענען השפּעה מיקראָטובולע ​​אָריענטירונג65, די יפעקץ פון GA אויף צעל טייל אָריענטירונג קען אויך זיין מידיייטיד דורך אנדערע כאָרמאָונז.
פרי סיטאָלאָגיקאַל שטודיום געוויזן אַז ביידע די ינער און ויסווייניקסט געגנטן פון די אַראַבידאָפּסיס סאַם זענען פארלאנגט פֿאַר ינטערנאָדע אַנטוויקלונג2,42. דער פאַקט אַז GA אַקטיוולי רעגיאַלייץ צעל אָפּטייל אין די ינער געוועבן 12 שטיצט אַ צווייענדיק פונקציע פון ​​GA אין רעגיאַלייטינג מעריסטעם און ינטערנאָדע גרייס אין די סאַם. דער מוסטער פון דיירעקשאַנאַל צעל אָפּטייל איז אויך טייטלי רעגיאַלייטאַד אין די ינער SAM געוועב, און די רעגולירן איז יקערדיק פֿאַר סטעם גראָוט52. עס וועט זיין טשיקאַווע צו ונטערזוכן צי GA אויך פיעסעס אַ ראָלע אין אָריענטינג די צעל אָפּטייל פלאַך אין די ינער SAM אָרגאַניזאַציע, דערמיט סינגקראַנייז די ספּעסיפיקאַטיאָן און אַנטוויקלונג פון ינטערנאָדעס אין די SAM.
געוויקסן זענען דערוואַקסן אין וויטראָ אין באָדן אָדער 1 קס Murashige-Skoog (MS) מיטל (Duchefa) סאַפּלאַמענטאַד מיט 1% סוקראָוס און 1% אַגאַר (סיגמאַ) אונטער נאָרמאַל טנאָים (16 שעה ליכט, 22 ° C), אַחוץ פֿאַר היפּאָקאָטיל און וואָרצל וווּקס יקספּעראַמאַנץ אין וואָס סידלינגז זענען דערוואַקסן אויף ווערטיקאַל פּלאַטעס אונטער קעסיידערדיק ליכט און 22 ° C. פֿאַר נייטרייט יקספּעראַמאַנץ, געוויקסן זענען דערוואַקסן אויף מאַדאַפייד מיז מיטל (ביאָוואָרלד פאַבריק מיטל) סאַפּלאַמענטאַד מיט טויגן נייטרייט (0 אָדער 10 מם קנאָ 3), 0.5 מם נה 4-סוקסינאַט, 1% סוקראָוס און 1% א-אַגאַר (סיגמאַ) אונטער לאַנג-טאָג טנאָים.
GID1a cDNA ינסערטאַד אין pDONR221 איז רעקאָמבינעד מיט pDONR P4-P1R-pUBQ10 און pDONR P2R-P3-mCherry אין pB7m34GW צו דזשענערייט pUBQ10 :: GID1a-mCherry. IDD2 דנאַ ינסערטאַד אין pDONR221 איז ריקאָמביינד אין pB7RWG266 צו דזשענערייט פּ35S:IDD2-RFP. צו דזשענערייט pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b, אַ 3.9 קב פראַגמענט אַפּסטרים פון די GID1b קאָדירונג געגנט און אַ 4.7 קב פראַגמענט מיט די GID1b cDNA (1.3 קב) און טערמינאַטאָר (3.4 קב) זענען ערשטער אַמפּלאַפייד מיט די אָנפאַנגער אין סאַפּלאַמענטערי טאַבלע 4-טהער 3 און דערנאָך אין פּר 1 טאַבלע 3. Fisher Scientific) און pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), ריספּעקטיוולי, און לעסאָף ריקאַמביינד מיט pDONR221 2xmTQ268 אין די pGreen 012567 ציל וועקטאָר ניצן גאַטעווייַ קלאָונינג. צו דזשענערייט pCUC2 :: LSSmOrange, די CUC2 פּראָמאָטער סיקוואַנס (3229 בפּ אַפּסטרים פון אַטג) נאכגעגאנגען דורך די קאָדירונג סיקוואַנס פון גרויס סטאָוקס-שיפטעד mOrange (LSSmOrange) 69 מיט די N7 יאָדער לאָוקאַלאַזיישאַן סיגנאַל און די NOS טראַנסקריפּטיאָנאַל טערמינאַטאָר זענען פארזאמלט אין די pGreencn 3, טאַרגאַטינג וועקטאָר קאַנאַמיי 3. (ינוויטראָגען). די פאַבריק ביינערי וועקטאָר איז ינטראָודוסט אין Agrobacterium tumefaciens שפּאַנונג GV3101 און ינטראָודוסט אין Nicotiana בענטהאַמיאַנאַ בלעטער דורך אַגראָבאַקטעריום ינפילטריישאַן אופֿן און אין אַראַבידאָפּסיס טהאַליאַנאַ קאָל-0 דורך פלאָראַל טונקען אופֿן, ריספּעקטיוולי. pUBQ10 :: qmRGA pUBQ10 :: GID1a-mCherry און pCLV3 :: mCherry-NLS qmRGA זענען אפגעזונדערט פון די F3 און F1 פּראַדזשינדזשיז פון די ריספּעקטיוו קראָסיז, ריספּעקטיוולי.
רנאַ אין סיטו כייברידיזיישאַן איז געווען דורכגעקאָכט אויף בעערעך 1 סענטימעטער לאַנג דרייען עצות72, וואָס זענען געזאמלט און גלייך פאַרפעסטיקט אין FAA לייזונג (3.7% פאָרמאַלדאַכייד, 5% אַסעטיק זויער, 50% עטאַנאָל) פאַר-קולד צו 4 °C. נאָך 2 × 15 מינוט וואַקוום טריטמאַנץ, די פיקסאַטיוו איז געביטן און סאַמפּאַלז זענען ינקובייטיד יבערנאַכטיק. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, און RGL3 cDNAs און אַנטיסענסע פּראָבעס צו זייער 3′-UTRs זענען סינטאַסייזד ניצן די פּרימערז געוויזן אין סאַפּלאַמענערי טאַבלע 3 ווי דיסקרייבד דורך Rosier et al.73. דיגאָקסיגענין-לייבאַלד פּראָבעס זענען יממונאָדעקטעד מיט דיגאָקסיגענין אַנטיבאָדיעס (3000-פאַרלייגן דיילושאַן; ראָטשע, קאַטאַלאָג נומער: 11 093 274 910), און סעקשאַנז זענען סטיינד מיט 5-בראָמאָ-4-טשלאָראָ-3-ינדאָליל פאָספאַטע (BCIP, 250-פאַרלייגן דיבלוטאַטיאָן, טראָבלועטאַטיאָן, 250-פאַרלייגן דיבלוטאַטיאָן) 200-פאַרלייגן דיילושאַן) לייזונג.