ופדעקונג, כאַראַקטעריזיישאַן און פאַנגקשאַנאַל פֿאַרבעסערונג פון ורסאַ מאָנאָאַמידעס ווי ראָמאַן פאַבריק גראָוט ינכיבאַטערז וואָס ווירקן פאַבריק מיקראָטובולעס.

דאנק איר פֿאַר באזוכן Nature.com.די ווערסיע פון ​​​​דעם בלעטערער איר נוצן האט לימיטעד CSS שטיצן.פֿאַר בעסטער רעזולטאַטן, מיר רעקאָמענדירן אַז איר נוצן אַ נייַער ווערסיע פון ​​דיין בלעטערער (אָדער דיסייבאַל קאַמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין Internet Explorer).אין דער דערווייל, צו ענשור אָנגאָינג שטיצן, מיר ווייַזן דעם פּלאַץ אָן סטילינג אָדער דזשאַוואַסקריפּט.
די ופדעקונג און וווילטויק נוצן פון נאַטירלעך פּראָדוקטן קענען העלפֿן פֿאַרבעסערן מענטשלעך לעבן.פּלאַנט גראָוט ינכיבאַטאָרי קעמיקאַלז זענען וויידלי געניצט ווי הערביסיידז צו קאָנטראָלירן ווידז.רעכט צו דער נויט צו נוצן פאַרשידענע טייפּס פון הערביסיידז, עס איז אַ נויט צו ידענטיפיצירן קאַמפּאַונדז מיט נייַע מעקאַניזאַמז פון קאַמף.אין דעם לערנען, מיר דיסקאַווערד אַ ראָמאַן N-אַלקאָקסיפּירראָלע קאַמפּאַונד, קאָומאַמאָנאַמידע, פֿון Streptomyces werraensis MK493-CF1 און געגרינדעט די גאַנץ סינטעז פּראָצעס.דורך בייאַלאַדזשיקאַל אַקטיוויטעטן אַסאַסאַז, מיר דיסקאַווערד אַז ורס-מאָנאָאַמיק זויער איז אַ סינטעטיש ינטערמידייט פון ורס-מאָנאָאַמידע און אַ פּאָטענציעלפאַבריק גראָוט ינכיבאַטער.אין אַדישאַן, מיר האָבן דעוועלאָפּעד פאַרשידן ורבענאָניק זויער דעריוואַטיווז, אַרייַנגערעכנט די ורבענילאָקסי דעריוואַטיוו (UDA), וואָס האט הויך הערביסידאַל טעטיקייט אָן נעגאַטיוו פּראַל אויף די וווּקס פון העלאַ סעלז.מיר אויך געפונען אַז ורמאָטאָניק זויער דעריוואַטיווז צעשטערן פאַבריק מיקראָטובולעס;אין דערצו, KAND אַפעקץ אַקטין פילאַמאַנץ און ינדוסיז צעל טויט;די מאַלטיפאַסאַטיד יפעקץ אַנדערש פון די פון באקאנט מיקראָטובולע ​​ינכיבאַטערז און פֿאָרשלאָגן אַ נייַע מעקאַניזאַם פון קאַמף פֿאַר ורסאָניק זויער, וואָס רעפּראַזענץ אַ וויכטיק מייַלע אין דער אַנטוויקלונג פון נייַע הערביסיידז.
די ופדעקונג און פּראַקטיש אַפּלאַקיישאַן פון וווילטויק נאַטירלעך פּראָדוקטן און זייער דעריוואַטיווז איז אַ מיטל צו פֿאַרבעסערן די קוואַליטעט פון מענטשלעך לעבן.צווייטיק מעטאַבאָליטעס געשאפן דורך מייקראָואָרגאַניזאַמז, געוויקסן און ינסעקץ האָבן געפֿירט צו הויפּט אַדוואַנסיז אין מעדיצין און אַגריקולטורע.פילע אַנטיביאַטיקס און אַנטי-לוקימיאַ דרוגס זענען דעוועלאָפּעד פון נאַטירלעך פּראָדוקטן.אין דערצו, פאַרשידן טייפּס פוןפּעסטאַסיידז, פאַנדזשאַסיידז און הערביסיידז זענען יקסטראַקטיד פון די נאַטירלעך פּראָדוקטן פֿאַר נוצן אין אַגריקולטורע.אין באַזונדער, וויד קאָנטראָל הערביסיידז זענען וויכטיק מכשירים פֿאַר ינקריסינג גערעטעניש ייעלדס אין מאָדערן אַגריקולטורע, און פאַרשידן טייפּס פון קאַמפּאַונדז זענען שוין קאַמערשאַלי געניצט.עטלעכע סעליאַלער פּראַסעסאַז אין געוויקסן, אַזאַ ווי פאָטאָסינטהעסיס, אַמינאָ זויער מאַטאַבאַליזאַם, צעל וואַנט סינטעז, רעגולירן פון מיטאָסיס, פיטאָהאָרמאָן סיגנאַלינג אָדער פּראָטעין סינטעז, זענען געהאלטן טיפּיש טאַרגאַץ פון הערביסיידז.קאַמפּאַונדז וואָס ינכיבאַט מיקראָטובולע ​​פונקציאָנירן זענען אַ פּראָסט קלאַס פון הערביסיידז וואָס ווירקן פאַבריק וווּקס דורך אַפעקטינג מיטאָטיק רעגולירן2.
מיקראָטובולעס זענען קאַמפּאָונאַנץ פון די סיטאָסקעלעטאָן און זענען וויידלי קאַנסערווד אין עוקאַריאָטיק סעלז.די טובולין העטעראָדימער באשטייט פון α-טובולין און β-טובולין פאָרמינג לינעאַר מיקראָטובולע ​​פּראָטאָפילאַמענץ, מיט 13 פּראָטאָפילאַמענץ פאָרמינג אַ סילינדריקאַל סטרוקטור.מיקראָטובולעס שפּילן קייפל ראָלעס אין פאַבריק סעלז, אַרייַנגערעכנט דיטערמאַנינג צעל פאָרעם, צעל אָפּטייל און ינטראַסעללולאַר אַריבערפירן 3,4.פּלאַנט סעלז אַנטהאַלטן מיקראָטובולעס אונטער די ינטערפאַסע פּלאַזמע מעמבראַנע, און די אַזוי גערופענע קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס זענען געדאַנק צו קאָנטראָלירן די אָרגאַניזאַציע פון ​​סעליאַלאָוס מיקראָפיברילז דורך די רעגולירן פון סעליאַלאָוס סינטאַסיס קאַמפּלעקסאַז4,5.קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס פון וואָרצל עפּאַדערמאַל סעלז, פאָרשטעלן אין דער זאָנע פון ​​גיך ילאָנגגיישאַן פון די וואָרצל שפּיץ, זענען ליגן לאַטעראַל, און סעליאַלאָוס מיקראָפיבער נאָכפאָלגן די מיקראָטובולעס און באַגרענעצן די ריכטונג פון צעל יקספּאַנשאַן, דערמיט פּראַמאָוטינג אַניסאָטראָפּיק צעל ילאָנגגיישאַן.דעריבער, מיקראָטובולע ​​פונקציע איז ענג שייַכות צו פאַבריק מאָרפאָלאָגי.אַמינאָ זויער סאַבסטיטיושאַנז אין גענעס וואָס קאָדירן טובולין פאַרשאַפן סקיוז פון קאָרטיקאַל מיקראָטובולע ​​ערייז און לינקס אָדער רעכט-סיידיד וווּקס אין אַראַבידאָפּסיס 6,7.סימילאַרלי, מיוטיישאַנז אין מיקראָטובולע-פארבונדן פּראָטעינס וואָס רעגולירן מיקראָטובולע ​​דינאַמיק קענען אויך פירן צו פאַרקרימט וואָרצל וווּקס8,9,10,11,12,13.אין אַדישאַן, באַהאַנדלונג מיט מיקראָטובולע-דיסראַפּטינג הערביסיידז אַזאַ ווי דיסאָפּיראַמידע, אויך באקאנט ווי פּרעטילאַטשלאָר, אויך ז לינקס-סיידיד אַבליק וואָרצל גראָוט14.די דאַטן אָנווייַזן אַז גענוי רעגולירן פון מיקראָטובולע ​​פונקציע איז קריטיש פֿאַר דיטערמאַנינג די ריכטונג פון פאַבריק וווּקס.
פאַרשידן טייפּס פון מיקראָטובולע ​​ינכיבאַטערז האָבן שוין דיסקאַווערד, און די דרוגס האָבן געמאכט באַטייַטיק קאַנטראַביושאַנז צו סיטאָסקעלעטאַל פאָרשונג, ווי געזונט ווי צו אַגריקולטורע און מעדיצין2.אין באַזונדער, אָריזאַלין, דיניטראָאַנילינע קאַמפּאַונדז, דיסאָפּיראַמידע, בענזאַמידע-פֿאַרבונדענע קאַמפּאַונדז און זייער אַנאַלאָגועס קענען ינכיבאַט מיקראָטובולע ​​פונקציאָנירן און דערמיט ינכיבאַט פאַבריק וווּקס.דעריבער, זיי זענען וויידלי געניצט ווי הערביסיידז.אָבער, זינט מיקראָטובולעס זענען אַ וויכטיק קאָמפּאָנענט פון פאַבריק און כייַע סעלז, רובֿ מיקראָטובולע ​​ינכיבאַטערז זענען סיטאָטאָקסיק צו ביידע צעל טייפּס.דעריבער, טראָץ זייער דערקענט נוצן ווי הערביסיידז, אַ לימיטעד נומער פון אַנטימיקראָטובולע ​​אגענטן זענען געניצט פֿאַר פּראַקטיש צוועקן.
סטרעפּטאָמיסעס איז אַ מין פון דער משפּחה סטרעפּטאָמיסעס, וואָס ינקלודז עראָוביק, גראַם-positive, פילאַמענטאָוס באַקטיריאַ און איז וויידלי באַוווסט פֿאַר זייַן פיייקייט צו פּראָדוצירן אַ ברייט קייט פון צווייטיק מעטאַבאָליטעס.דעריבער, עס איז געהאלטן איינער פון די מערסט וויכטיק קוואלן פון נייַ בייאַלאַדזשיקלי אַקטיוו נאַטירלעך פּראָדוקטן.אין דעם קראַנט לערנען, מיר דיסקאַווערד אַ נייַע קאַמפּאַונד גערופן קאָומאַמאָנאַמידע, וואָס איז געווען אפגעזונדערט פון Streptomyces werraensis MK493-CF1 און S. werraensis ISP 5486. ניצן ספּעקטראַל אַנאַליסיס און פול ספּעקטראַל אַנאַליסיס, די סטרוקטור פון קאָומאַמאָנאַמידע איז קעראַקטערייזד און זייַן יינציק N-אַלקאָקסיפּירראָלע סקעלעט. איז באשלאסן געווארן.סינטעז.ורסמאָניק זויער, אַ סינטעטיש ינטערמידייט פון ורסמאָנאָאַמידע און זייַן דעריוואַטיווז, איז געפונען צו ינכיבאַט די וווּקס און דזשערמאַניישאַן פון די פאָלקס מאָדעל פאַבריק אַראַבידאָפּסיס טהאַליאַנאַ.אין אַ סטרוקטור-אַקטיוויטעט שייכות לערנען, מיר געפֿונען אַז אַ קאַמפּאַונד מיט C9 מאַדאַפייד צו ורסאָניק זויער, גערופֿן נאָנילאָקסי דעריוואַט פון ורסאָניק זויער (KAND), ימפּרוווז די ינכיבאַטערי ווירקונג אויף וווּקס און דזשערמאַניישאַן באטייטיק.נאָוטאַבלי, די ניי דיסקאַווערד פאַבריק גראָוט ינכיבאַטער אויך אַפעקטאַד די וווּקס פון טאַביק און לעבערוואָרט און איז נישט סיטאָטאָקסיק צו באַקטיריאַ אָדער העלאַ סעלז.דערצו, עטלעכע ורמאָטאָניק זויער דעריוואַטיווז ינדוסירן אַ פאַרקרימט וואָרצל פענאָטיפּע, ימפּלייינג אַז די דעריוואַטיווז גלייך אָדער מינאַצאַד ווירקן מיקראָטובולעס.קאָנסיסטענט מיט דעם געדאַנק, אונדזער אַבזערוויישאַנז פון מיקראָטובולעס מיטן נאָמען אָדער יממונאָהיסטאָטשעמיקלי אָדער מיט פלורעסאַנט פּראָטעינס אָנווייַזן אַז KAND באַהאַנדלונג דעפּאָלימערייזיז מיקראָטובולעס.אין דערצו, באַהאַנדלונג מיט קומאַמאָטאָניק זויער דעריוואַטיווז דיסראַפּטיד אַקטין מיקראָפילאַמענץ.אזוי, מיר האָבן דיסקאַווערד אַ נייַ פאַבריק גראָוט ינכיבאַטער וועמענס יינציק מעקאַניזאַם פון קאַמף ינוואַלווז צעשטערונג פון די סיטאָסקעלעטאָן.
שפּאַנונג MK493-CF1 איז אפגעזונדערט פון באָדן אין שינאַגאַוואַ-קו, טאָקיאָ.שפּאַנונג MK493-CF1 האָט געשאפן געזונט-בראַנטשט סטראָמאַל מיסעליום.די פּאַרטיייש סיקוואַנס פון די 16S ריבאָסאָמאַל רנאַ דזשין (1422 בפּ) איז באשלאסן.דער שפּאַנונג איז זייער ענלעך צו S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: טיפּיש שפּאַנונג, 99.93%).באַזירט אויף דעם רעזולטאַט, עס איז באשלאסן אַז דעם שפּאַנונג איז ענג שייַכות צו די טיפּ שפּאַנונג פון S. werraensis.דעריבער, מיר דערווייַל געהייסן דעם שפּאַנונג S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T אויך טראגט די זעלבע ביאָאַקטיווע קאַמפּאַונדז.זינט עס איז געווען קליין פרי פאָרשונג צו באַקומען נאַטירלעך פּראָדוקטן פון דעם מייקראָואָרגאַניזאַם, ווייַטער כעמישער פאָרשונג איז דורכגעקאָכט.נאָך קאַלטיוויישאַן פון S. werraensis MK493-CF1 אויף גערשטן מיטל דורך האַרט-שטאַט פערמאַנטיישאַן ביי 30 ° C פֿאַר 14 טעג, די מיטל איז יקסטראַקטיד מיט 50% עטאָה.60 מל פון מוסטער איז דאַר צו באַקומען 59.5 מג פון גראָב עקסטראַקט.די גראָב עקסטראַקט איז געווען אונטערטעניק צו פאַרקערט פאַסע הפּלק צו געבן N-מעטהאָקסי-1 ה-פּירראָלע-2-קאַרבאָקסאַמידע (1, געהייסן קאָומאַמאָנאַמידע, 36.0 מג).די גאַנץ סומע פון ​​1 איז בעערעך 60% פון די גראָב עקסטראַקט.דעריבער, מיר באַשלאָסן צו לערנען אין דעטאַל די פּראָפּערטיעס פון קומאַמאָטאָאַמידע 1.
Coumamonamide 1 איז אַ ווייַס אַמאָרפאַס פּודער און הויך האַכלאָטע מאַסע ספּעקטראָמעטרי (HRESIMS) קאַנפערמז C6H8N2O2 (Fig. 1).די C2-substituted פּיראָל פראַגמענט פון דעם קאַמפּאַונד איז קעראַקטערייזד דורך δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH אין 1H NMR ספּעקטרום: 4.5 Hz , H-5) און δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), און די 13C NMR ספּעקטרום ווייזט די בייַזייַן פון פיר ספּ2 טשאַד אַטאָמס.די בייַזייַן פון אַ אַמידע גרופּע אין די C2 שטעלע איז אַססעססעד דורך HMBC קאָראַליישאַן פון די C-3 פּראָטאָן צו די אַמידע קאַרבאָניל טשאַד ביי δC 161.1.אין אַדישאַן, 1 H און 13 C NMR פּיקס ביי δH 4.10 (3H, S) און δC 68.3 אָנווייַזן דעם בייַזייַן פון N-מעטהאָקסי גרופּעס אין די מאַלאַקיול.כאָטש די ריכטיק שטעלע פון ​​די מעטהאָקסי גרופּע איז נאָך נישט באשלאסן מיט ספּעקטראָסקאָפּיק אַנאַליסיס אַזאַ ווי ימפּרוווד חילוק ספּעקטראָסקאָפּי און יאָדער אָווערהאַוסער אַבריווייישאַן (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide געווארן דער ערשטער קאַנדידאַט קאַמפּאַונד.
צו באַשטימען די ריכטיק סטרוקטור פון 1, אַ גאַנץ סינטעז איז דורכגעקאָכט (Fig. 2a).באַהאַנדלונג פון קאמערשעל בנימצא 2-aminopyridine 2 מיט m-CPBA ריזאַלטיד אין די קאָראַספּאַנדינג N-אַקסייד 3 אין קוואַנטיטאַטיווע טראָגן.נאָך די 2-אַמינאָאַזידאַטיאָן פון 2, די סיקלאָקאָנדענסאַטיאָן רעאַקציע דיסקרייבד דורך אַבראַמאָוויטש איז דורכגעקאָכט אין בענזין ביי 90 ° C צו באַקומען די געוואלט 1-כיידראָקסי-1 ה-פּירראָלע-2-קאַרבאָניטרילע 5 אין גראַמז.גיכקייַט 60% (צוויי סטאַגעס).15,16.מעטהילאַטיאָן און כיידראַלאַסאַס פון 4 דעמאָלט געגעבן 1-מעטהאָקסי-1ה-פּירראָלע-2-קאַרבאָקסיליק זויער (גערעדט "קומאָטאָניק זויער", 6) אין גוט טראָגן (70%, צוויי טריט).צום סוף, אַמידיישאַן דורך זויער קלאָרייד ינטערמידייט 6 ניצן ייקוויאַס אַמאָוניאַ געגעבן קומאַמאָטאָ אַמידע 1 אין 98% טראָגן.אַלע ספּעקטראַל דאַטן פון סינטאַסייזד קסנומקס זענען ענלעך צו אפגעזונדערט קסנומקס, אַזוי די סטרוקטור פון קסנומקס איז באשלאסן;
אַלגעמיינע סינטעז און אַנאַליסיס פון די בייאַלאַדזשיקאַל טעטיקייט פון ורבענאַמידע און ורבעניק זויער.(אַ) גאַנץ סינטעז פון קומאַמאָטאָ אַמידע.(ב) זיבן-טאָג-אַלט ווילד-טיפּ אַראַבידאָפּסיס קאָלאָמביע (קאָל) סידלינגז זענען דערוואַקסן אויף מוראַשיגע און סקאָאָג (מס) פּלאַטעס מיט קאָומאַמאָנאַמידע 6 אָדער קאָוממאָנאַמאַדע 1 אין די אנגעוויזן קאַנסאַנטריישאַנז.וואָג באַר = 1 סענטימעטער.
ערשטער, מיר אַססעססעד די בייאַלאַדזשיקאַל אַקטיוויטעטן פון ורבענאַמידע און זייַן ינטערמידיאַץ פֿאַר זייער פיייקייט צו מאָדולירן פאַבריק וווּקס.מיר צוגעגעבן פאַרשידן קאַנסאַנטריישאַנז פון ורסמאָנאַמאַדע 1 אָדער ורסמאָניק זויער 6 צו MS אַגאַר מיטל און געבילדעטער אַראַבידאָפּסיס טהאַליאַנאַ סידלינגז אויף דעם מיטל.די אַסאַסאַז געוויזן אַז הויך קאַנסאַנטריישאַנז (500 μם) פון 6 ינכיבאַטיד וואָרצל גראָוט (Fig. 2b).דערנאָך, מיר דזשענערייטאַד פאַרשידן דעריוואַטיווז דורך סאַבסטיטוטינג די N1 שטעלע פון ​​6 און דורכגעקאָכט סטרוקטור-אַקטיוויטעט שייכות שטודיום אויף זיי (די אַנאַלאָג סינטעז פּראָצעס איז דיסקרייבד אין די שטיצן אינפֿאָרמאַציע (SI)).אַראַבידאָפּסיס סידלינגז זענען דערוואַקסן אויף אַ מיטל מיט 50 μם ורסאָניק זויער דעריוואַטיווז, און וואָרצל לענג איז געמאסטן.ווי עס איז געוויזן אויף די בילד.ווי געוויזן אין פיגיערז 3 אַ, ב, און ס 1, קאָומאַמאָ אַסאַדז האָבן פאַרשידענע לענגקטס פון לינעאַר אַלקאָקסי קייטן (9, 10, 11, 12 און 13) אָדער גרויס אַלקאָקסי קייטן (15, 16 און 17) אין די N1 שטעלע.די דעריוואַטיווז געוויזן באַטייַטיק ינאַבישאַן פון וואָרצל וווּקס.אין דערצו, מיר געפונען אַז אַפּלאַקיישאַן פון 200 μם 10, 11, אָדער 17 ינכיבאַטיד דזשערמאַניישאַן (Figs. 3 ק און ס 2).
לערנען פון די סטרוקטור-אַקטיוויטעט שייכות פון קומאַמאָטאָ אַמידע און פֿאַרבונדענע קאַמפּאַונדז.(אַ) סטרוקטור און סינטעז סכעמע פון ​​אַנאַלאָגועס.(ב) קוואַנטיפיקאַטיאָן פון וואָרצל לענג פון 7-טאָג-אַלט סידלינגז דערוואַקסן אויף MS מיטל מיט אָדער אָן 50 μם קאָומאַמאָנאַמידע דעריוואַטיווז.אַסטעריסקס אָנווייַזן באַטייַטיק דיפעראַנסיז מיט שעמעוודיק באַהאַנדלונג (ה טעסט, ז<0.05).n>18. דאַטן זענען געוויזן ווי מיינען ± סד.nt מיטל "ניט טעסטעד" ווייַל מער ווי 50% פון די זאמען זענען נישט דזשערמאַנייטיד.(C) קוואַנטיפיקאַטיאָן פון דזשערמאַניישאַן קורס פון באהאנדלט זאמען ינגקיובייטיד פֿאַר 7 טעג אין MS מיטל מיט אָדער אָן 200 μם קאָומאַמאָנאַמידע און פֿאַרבונדענע קאַמפּאַונדז.אַסטעריסקס אָנווייַזן באַטייַטיק דיפעראַנסיז מיט שאַם באַהאַנדלונג (קיי-קוואַדראַט פּרובירן).n=96.
ינטערעסטינגלי, די אַדישאַן פון אַלקיל זייַט קייטן מער ווי C9 רידוסט די ינכיבאַטערי טעטיקייט, סאַגדזשעסטינג אַז קומאַמאָטאָיק זויער-פֿאַרבונדענע קאַמפּאַונדז דאַרפן זייַט קייטן פון אַ זיכער גרייס צו ויסשטעלונג זייער בייאַלאַדזשיקאַל טעטיקייט.
ווייַל די אַנאַליסיס פון סטרוקטור-אַקטיוויטעט באַציונגען האט געוויזן אַז C9 איז געווען מאַדאַפייד צו ורסאָניק זויער און די נאָנילאָקסי דעריוואַט פון ורסאָניק זויער (דערנאָכדעם ריפערד צו ווי KAND 11) איז געווען די מערסט עפעקטיוו פאַבריק גראָוט ינכיבאַטער, מיר געפירט אַ מער דיטיילד קעראַקטעריסטיקס פון KAND 11. באַהאַנדלונג פון אַראַבידאָפּסיס מיט 50 μM KAND 11 כּמעט גאָר פּריווענטיד דזשערמאַניישאַן, כוועראַז נידעריקער קאַנסאַנטריישאַנז (40, 30, 20, אָדער 10 μM) פון KAND 11 ינכיבאַטאַד וואָרצל וווּקס אין אַ דאָזע-אָפענגיק שטייגער (Fig. 4 אַ, ב).צו פּרובירן צי KAND 11 אַפעקץ וואָרצל מעריסטעם ווייאַבילאַטי, מיר יגזאַמאַנד וואָרצל מעריסטאַמז סטיינד מיט פּראָפּידיום יאָדידע (פּי) און געמאסטן מעריסטעם שטח גרייס.די גרייס פון דעם מעריסטעם פון סידלינגז דערוואַקסן אויף אַ מיטל מיט 25 μM KAND-11 איז געווען 151.1 ± 32.5 μם, בשעת די גרייס פון די מעריסטעם פון סידלינגז דערוואַקסן אויף אַ קאָנטראָל מיטל מיט דמסאָ איז 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d) , וואָס ינדיקייץ אַז KAND-11 ריסטאָרז סעליאַלער טעטיקייט.פארשפרייטן.וואָרצל מעריסטעם.קאָנסיסטענט מיט דעם, KAND 11 באַהאַנדלונג רידוסט די סומע פון ​​צעל אָפּטייל מאַרקער CDKB2;1p ::CDKB2;1-GUS סיגנאַל אין די וואָרצל מעריסטעם (Fig. 4e) 17.די רעזולטאַטן אָנווייַזן אַז KAND 11 ינכיבאַץ וואָרצל גראָוט דורך רידוסינג צעל פּראָוליפעריישאַן טעטיקייט.
אַנאַליסיס פון די ינכיבאַטאָרי ווירקונג פון ורבענאָניק זויער דעריוואַטיווז (ורבענילאָקסי דעריוואַטיווז) אויף וווּקס.(אַ) 7-טאָג-אַלט ווילד-טיפּ קאָל סידלינגז דערוואַקסן אויף מיז פּלאַטעס מיט די אנגעוויזן קאַנסאַנטריישאַנז פון KAND 11. וואָג באַר = 1 סענטימעטער.(ב) קוואַנטיפיקאַטיאָן פון וואָרצל לענג.אותיות אָנווייַזן באַטייטיק דיפעראַנסיז (Tukey HSD פּרובירן, ז<0.05).n>16. דאַטן זענען געוויזן ווי מיינען ± סד.(C) קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּי פון פּראָפּידיום ייאַדייד-סטיינד ווילד-טיפּ קאָל רוץ דערוואַקסן אויף מיז פּלאַטעס מיט אָדער אָן 25 μM KAND 11. ווייַס בראַקאַץ אָנווייַזן וואָרצל מעריסטעם.וואָג באַר = 100 μם.(ד) קוואַנטיפיקאַטיאָן פון וואָרצל מעריסטעם גרייס (n = 10-11).סטאַטיסטיש דיפעראַנסיז זענען באשלאסן מיט ט-פּרובירן (ז<0.05).די באַרס רעפּראַזענץ די דורכשניטלעך מעריסטעם גרייס.(e) דיפפערענטשאַל ינטערפיראַנס קאַנטראַסט (דיק) מיקראָסקאָפּי פון אַ וואָרצל מעריסטעם מיט די CDKB2 בויען;1פּראָ: CDKB2;1-GUS סטיינד און סטיינד אויף 5-טאָג-אַלט סידלינגז דערוואַקסן אויף MS פּלאַטעס מיט אָדער אָן 25 μM KAND אַססייַ.
די פיטאָטאָקסיסיטי פון KAND 11 איז נאָך טעסטעד מיט אן אנדער דיקאָטילעדאָנאָוס פאַבריק, טאַביק (Nicotiana tabacum), און אַ הויפּט לאַנד פאַבריק מאָדעל אָרגאַניזם, לעבערוואָרט (Marchantia polymorpha).ווי אין דעם פאַל פון אַראַבידאָפּסיס, טאַביק SR-1 סידלינגז דערוואַקסן אויף מיטל מיט 25 μM KAND 11 געשאפן קירצער רוץ (Fig. 5 אַ).אַדדיטיאָנאַללי, 40 פון 48 זאמען דזשערמאַנייטיד אויף פּלאַטעס מיט 200 μM KAND 11, כוועראַז אַלע 48 זאמען דזשערמאַנייטיד אויף רייצנ-באהאנדלט מידיאַ, ינדאַקייטינג אַז העכער קאַנסאַנטריישאַנז פון KAND זענען באַטייַטיק (פּ)< 0.05;טשי פּרובירן -קוואַדראַט) ינכיבאַטיד די דזשערמאַניישאַן פון טאַביק.(פיג. 5 ב).אין דערצו, די קאַנסאַנטריישאַן פון KAND 11 וואָס ינכיבאַט באַקטיריאַל וווּקס אין לעבערוואָרט איז געווען ענלעך צו די עפעקטיוו קאַנסאַנטריישאַן אין אַראַבידאָפּסיס (Fig. 5c).די רעזולטאַטן אָנווייַזן אַז KAND 11 קענען ינכיבאַט דעם וווּקס פון פאַרשידן געוויקסן.דערנאָך מיר ינוועסטאַגייטאַד די מעגלעך סיטאָטאָקסיסיטי פון בער מאָנאָאַמידע-פֿאַרבונדענע קאַמפּאַונדז אין אנדערע אָרגאַניזאַמז, ניימלי מענטשלעך העלאַ סעלז און Escherichia coli שפּאַנונג DH5α, ווי פארשטייערס פון העכער כייַע און באַקטיריאַל סעלז ריספּעקטיוולי.אין אַ סעריע פון ​​צעל פּראָוליפעריישאַן אַסאַסאַז, מיר באמערקט אַז קאָומאַמאָנאַמידע 1, קאָומאַמאָנאַמידיק זויער 6 און קאַנד 11 האט נישט ווירקן די וווּקס פון העלאַ אָדער E. קאָלי סעלז אין קאַנסאַנטריישאַנז פון 100 μם (Fig. 5 ד, E).
גראָוט ינאַבישאַן פון KAND 11 אין ניט-אַראַבידאָפּסיס אָרגאַניזאַמז.(אַ) צוויי-וואָך-אַלט ווילד-טיפּ SR-1 טאַביק סידלינגז זענען דערוואַקסן אויף ווערטיקלי פּאַזישאַנד מיז פּלאַטעס מיט 25 μM KAND 11. (ב) צוויי-וואָך-אַלט ווילד-טיפּ SR-1 טאַביק סידלינגז זענען דערוואַקסן אויף כאָריזאַנטאַלי פּאַזישאַנד. MS פּלאַטעס מיט 200 μM KAND 11. (C) צוויי-וואָך-אַלט ווילד-טיפּ טאַק-1 ליווערוואָרט באַדז דערוואַקסן אויף Gamborg B5 פּלאַטעס מיט די אנגעוויזן קאַנסאַנטריישאַנז פון KAND 11. רויט אַראָוז אָנווייַזן ספּאָרז וואָס פארשטאפט גראָוינג אין די צוויי-וואָך ינגקיוביישאַן צייַט.(ד) צעל פּראָוליפעריישאַן אַססייַ פון העלאַ סעלז.די נומער פון ווייאַבאַל סעלז איז געמאסטן אין פאַרפעסטיקט צייט ינטערוואַלז ניצן אַ צעל קאַונטינג ינווענטאַר 8 (Dojindo).ווי אַ קאָנטראָל, HeLa סעלז זענען באהאנדלט מיט 5 μג / מל אַקטינאָמיסין ד (אקט ד), וואָס ינכיבאַץ רנאַ פּאָלימעראַסע טראַנסקריפּציע און ז צעל טויט.אַנאַליזעס זענען דורכגעקאָכט אין טריפּליקאַט.(E) E. קאָלי צעל פּראָוליפעריישאַן אַסייַ.י קאָלי גראָוט איז אַנאַלייזד דורך מעסטן אָד600.ווי אַ קאָנטראָל, סעלז זענען באהאנדלט מיט 50 μג / מל אַמפּיסיללין (אַמפּ), וואָס ינכיבאַץ באַקטיריאַל צעל וואַנט סינטעז.אַנאַליזעס זענען דורכגעקאָכט אין טריפּליקאַט.
צו דיסייפער די מעקאַניזאַם פון קאַמף פון סיטאָטאָקסיסיטי געפֿירט דורך וראַמידע-פֿאַרבונדענע קאַמפּאַונדז, מיר ריאַנאַלייזד ורבעניק זויער דעריוואַטיווז מיט מעסיק ינכיבאַטערי יפעקץ.ווי עס איז געוויזן אויף די בילד.ווי געוויזן אין פיגיערז 2b, 6a, סידלינגז דערוואַקסן אויף אַגאַר פּלאַטעס מיט הויך קאַנסאַנטריישאַנז (200 μM) פון ורמאָטאָניק זויער 6 געשאפן קירצער און לינקס-קערווד רוץ (θ = - 23.7 ± 6.1), כוועראַז סידלינגז דערוואַקסן אויף די קאָנטראָל מיטל, די סידלינגז געשאפן כּמעט גלייַך רוץ (θ = - 3.8 ± 7.1).דעם כאַראַקטעריסטיש אַבליק וווּקס איז באקאנט צו רעזולטאַט פון דיספאַנגקשאַן פון קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס14,18.קאָנסיסטענט מיט דעם דערגייונג, די מיקראָטובולע-דיסטייבאַלייזינג דרוגס דיסאָפּיראַמידע און אָריזאַלין ינדוסט ענלעך וואָרצל טילטינג אונטער אונדזער וווּקס טנאָים (Figs. 2b, 6a).אין דער זעלביקער צייט, מיר טעסטעד ורמאָטאָניק זויער דעריוואַטיווז און אויסגעקליבן עטלעכע פון ​​זיי וואָס, אין זיכער קאַנסאַנטריישאַנז, ינדוסט אַבליק וואָרצל וווּקס.קאַמפּאַונדז 8, 9 און 15 ריספּעקטיוולי טשיינדזשד די ריכטונג פון וואָרצל וווּקס ביי 75 μם, 50 μם און 40 μם, וואָס ינדיקייץ אַז די קאַמפּאַונדז קענען יפעקטיוולי דיסטייבאַלייז מיקראָטובולעס (Fig. 2b, 6a).מיר אויך טעסטעד די מערסט שטאַרק ורסאָליק זויער דעריוואַט, KAND 11, אין אַ נידעריקער קאַנסאַנטריישאַן (15 μM) און געפֿונען אַז אַפּלאַקיישאַן פון KAND 11 ינכיבאַטיד וואָרצל וווּקס און אַז דער ריכטונג פון וואָרצל וווּקס איז אַניוואַן, כאָטש זיי טענד צו שיפּוע צו די לינקס ( פיגורע C3)..ווייַל העכער קאַנסאַנטריישאַנז פון מיקראָטובולע-דיסטייבאַלייזינג דרוגס מאל ינכיבאַט פאַבריק וווּקס אלא ווי גרונט וואָרצל טילטינג, מיר דערנאָך אַססעססעד די מעגלעכקייט אַז KAND 11 אַפעקץ מיקראָטובולעס דורך אַבזערווינג קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס אין וואָרצל עפּאַדערמאַל סעלז.יממונאָהיסטאָטשעמיסטרי ניצן אַנטי-β-טובולין אַנטיבאָדיעס אין עפּאַדערמאַל סעלז פון סידלינג רוץ באהאנדלט מיט 25 μM KAND 11 געוויזן די דיסאַפּיראַנס פון כּמעט אַלע קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס אין עפּאַדערמאַל סעלז אין די ילאָנגגיישאַן זאָנע (Fig. 6b).די רעזולטאַטן אָנווייַזן אַז קומאַמאָטאָניק זויער און זייַן דעריוואַטיווז אַקט גלייַך אָדער מינאַצאַד אויף מיקראָטובולעס צו צעשטערן זיי און אַז די קאַמפּאַונדז זענען ראָמאַן מיקראָטובולע ​​ינכיבאַטערז.
ורסאָניק זויער און זייַן דעריוואַטיווז טוישן די קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס אין אַראַבידאָפּסיס טהאַליאַנאַ.(אַ) וואָרצל יצר ווינקל געמאסטן אין דעם בייַזייַן פון פאַרשידן ורמאָטאָניק זויער דעריוואַטיווז אין די אנגעוויזן קאַנסאַנטריישאַנז.די ווירקונג פון צוויי קאַמפּאַונדז באקאנט צו ינכיבאַט מיקראָטובולעס: דיסאָפּיראַמידע און אָריזאַלין זענען אויך אַנאַלייזד.די ינסעט ווייזט די סטאַנדאַרט געניצט צו מעסטן וואָרצל וווּקס ווינקל.אַסטעריסקס אָנווייַזן באַטייַטיק דיפעראַנסיז מיט שעמעוודיק באַהאַנדלונג (ה טעסט, ז<0.05).n>19. וואָג באַר = 1 סענטימעטער.(ב) קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס אין עפּאַדערמאַל סעלז אין די ילאָנגגיישאַן זאָנע.מיקראָטובולעס אין ווילד-טיפּ אַראַבידאָפּסיס קאָל רוץ דערוואַקסן אויף מיז פּלאַטעס מיט אָדער אָן 25 μM KAND 11 זענען וויזשוואַלייזד דורך ימיונאָכיסטעמיקאַל סטיינינג ניצן β-טובולין ערשטיק אַנטיבאָדיעס און Alexa פלואָר-קאָנדזשוגאַטעד צווייטיק אַנטיבאָדיעס.וואָג באַר = 10 μם.(C) מיטאָטיק סטרוקטור פון מיקראָטובולעס אין די וואָרצל מעריסטעם.מיקראָטובולעס זענען וויזשוואַלייזד מיט יממונאָהיסטאָטשעמיקאַל סטיינינג.מיטאָטיש סטראַקטשערז, אַרייַנגערעכנט פּראָפאַסע זאָנעס, ספּינדאַלז און פראַגמאָפּלאַסטס, זענען גערעכנט פֿון קאָנפאָקאַל בילדער.אַראָוז אָנווייַזן מיטאָטיש מיקראָטובולע ​​סטראַקטשערז.אַסטעריסקס אָנווייַזן באַטייַטיק דיפעראַנסיז מיט שעמעוודיק באַהאַנדלונג (ה טעסט, ז<0.05).n>9. וואָג באַר = 50 μם.
כאָטש Ursa האט די פיייקייט צו צעשטערן מיקראָטובולע ​​פונקציאָנירן, די מעקאַניזאַם פון קאַמף איז דערוואַרט צו זיין אַנדערש פון טיפּיש מיקראָטובולע ​​דעפּאָלימערייזינג אגענטן.פֿאַר בייַשפּיל, העכער קאַנסאַנטריישאַנז פון מיקראָטובולע ​​דעפּאָלימערייזינג אגענטן אַזאַ ווי דיסאָפּיראַמידע און אָריזאַלין ינדוסירן אַניסאָטראָפּיק יקספּאַנשאַן פון עפּאַדערמאַל סעלז, כאָטש KAND 11 טוט נישט.אין דערצו, קאָ-אַפּלאַקיישאַן פון KAND 11 און דיסאָפּיראַמידע ריזאַלטיד אין אַ קאַמביינד דיסאָפּיראַמידע-ינדוסט וואָרצל וווּקס ענטפער און קאַנד 11-ינדוסט גראָוט ינאַבישאַן איז באמערקט (Fig. S4).מיר אויך אַנאַלייזד די ענטפער פון די כייפּערסענסיטיוו דיסאָפּיראַמידע 1-1 (פס1-1) מוטאַנט צו KAND 11. phs1-1 האט אַ ניט-קאַנאָניקאַל טובולין קינאַסע פונט מיוטיישאַן און טראגט קירצער רוץ ווען באהאנדלט מיט דיסאָפּיראַמידע9,20.phs1-1 מיוטאַנט סידלינגז דערוואַקסן אויף אַגאַר מיטל מיט קאַנד 11 האט קירצער רוץ ענלעך צו די דערוואַקסן אויף דיסאָפּיראַמיד (פיגורע ס 5).
אין אַדישאַן, מיר באמערקט מיטאָטיש מיקראָטובולע ​​סטראַקטשערז, אַזאַ ווי פּראָפאַסע זאָנעס, ספּינדאַלז און פראַגמאָפּלאַסטס, אין די וואָרצל מעריסטעם פון סידלינגז באהאנדלט מיט KAND 11. לויט די אַבזערוויישאַנז פֿאַר CDKB2;1p ::CDKB2;1-GUS, אַ באַטייטיק פאַרקלענערן אין די נומער פון מיטאָטיק מיקראָטובולעס איז באמערקט (Fig. .6c).
צו קעראַקטערייז די סיטאָטאָקסיסיטי פון KAND 11 ביי סובסעללולאַר האַכלאָטע, מיר באהאנדלט טאַביק BY-2 סאַספּענשאַן סעלז מיט KAND 11 און באמערקט זייער ענטפער.מיר ערשטער צוגעגעבן KAND 11 צו BY-2 סעלז וואָס יקספּרעסינג TagRFP-TUA6, וואָס פלורעסאַנטלי לאַבעלס מיקראָטובולעס, צו אַססעסס די ווירקונג פון KAND 11 אויף קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס.קאָרטיקאַל מיקראָטובולע ​​געדיכטקייַט איז אַססעססעד מיט בילד אַנאַליסיס, וואָס קוואַנטאַפייד די פּראָצענט פון סיטאָסקעלעטאַל בילדצעלן צווישן סיטאָפּלאַסמיק בילדצעלן.די רעזולטאַטן געוויזן אַז נאָך באַהאַנדלונג מיט 50 μM אָדער 100 μM KAND 11 פֿאַר 1 שעה, די געדיכטקייַט דיקריסט באטייטיק צו 0.94 ± 0.74% אָדער 0.23 ± 0.28% ריספּעקטיוולי, בשעת די געדיכטקייַט פון סעלז באהאנדלט מיט DMSO, אַמאַוניד צו 61 ± 0. % (פיג. 7 אַ).די רעזולטאַטן זענען קאָנסיסטענט מיט די אָבסערוואַציע אין אַראַבידאָפּסיס אַז קאַנד 11 באַהאַנדלונג ינדוסיז דעפּאָלימעראַזיישאַן פון קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס (Fig. 6ב).מיר אויך יגזאַמאַנד די BY-2 שורה מיט GFP-ABD-לייבאַלד אַקטין פילאַמאַנץ נאָך באַהאַנדלונג מיט דער זעלביקער קאַנסאַנטריישאַן פון KAND 11 און באמערקט אַז KAND 11 באַהאַנדלונג דיסראַפּטיד די אַקטין פילאַמאַנץ.באַהאַנדלונג מיט 50 μM אָדער 100 μM KAND 11 פֿאַר 1 שעה באטייטיק רידוסט אַקטין פאָדעם געדיכטקייַט צו 1.20 ± 0.62% אָדער 0.61 ± 0.26%, ריספּעקטיוולי, כוועראַז די געדיכטקייַט אין דמסאָ-באהאנדלט סעלז איז געווען 1.69 ± 0.69% (יג).7ב).די רעזולטאַטן קאַנטראַסט מיט די יפעקץ פון פּראָפּיזאַמידע, וואָס טוט נישט ווירקן אַקטין פילאַמאַנץ, און לאַטרונקולין ב, אַן אַקטין דעפּאָלימעריזער וואָס טוט נישט ווירקן מיקראָטובולעס (סי פיגור ס 6).אין אַדישאַן, באַהאַנדלונג מיט קאָומאַמאָנאַמידע 1, קאָומאַמאָנאַמידע זויער 6 אָדער KAND 11 האט נישט ווירקן מיקראָטובולעס אין העלאַ סעלז (סי פיגור ס 7).אזוי, די מעקאַניזאַם פון קאַמף פון KAND 11 איז געגלויבט צו זיין אַנדערש פון די פון באַוווסט סיטאָסקעלעטאָן דיסראַפּטערז.אין אַדישאַן, אונדזער מיקראָסקאָפּיק אָבסערוואַציע פון ​​BY-2 סעלז באהאנדלט מיט KAND 11 אנטפלעקט די אָנסעט פון צעל טויט בעשאַס KAND 11 באַהאַנדלונג און געוויזן אַז די פּראָפּאָרציע פון ​​​​עוואַנס בלוי-סטיינד טויט סעלז איז נישט ינקריסינג באטייטיק נאָך 30 מינוט פון KAND 11 באַהאַנדלונג, כוועראַז נאָך 90 מינוט פון באַהאַנדלונג מיט 50 μM אָדער 100 μM KAND, די נומער פון טויט סעלז געוואקסן צו 43.7% אָדער 80.1% ריספּעקטיוולי (Fig. 7c).צוזאַמען, די דאַטן אָנווייַזן אַז דער ראָמאַן ורסאָליק זויער דעריוואַט KAND 11 איז אַ פאַבריק-ספּעציפיש סיטאָסקעלעטאַל ינכיבאַטער מיט אַ ביז אַהער אומבאַקאַנט מעקאַניזאַם פון קאַמף.
KAND אַפעקץ קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס, אַקטין פילאַמאַנץ און ווייאַבילאַטי פון טאַביק BY-2 סעלז.(אַ) וויסואַליזאַטיאָן פון קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס אין BY-2 סעלז אין דעם בייַזייַן פון TagRFP-TUA6.BY-2 סעלז באהאנדלט מיט KAND 11 (50 μM אָדער 100 μM) אָדער DMSO זענען יגזאַמאַנד דורך קאַנפאָקאַל מיקראָסקאָפּי.קאָרטיקאַל מיקראָטובולע ​​געדיכטקייַט איז קאַלקיאַלייטיד פון מיקראָגראַפס פון 25 פרייַ סעלז.אותיות אָנווייַזן באַטייטיק דיפעראַנסיז (Tukey HSD פּרובירן, ז<0.05).וואָג באַר = 10 μם.(ב) קאָרטיקאַל אַקטין פילאַמאַנץ אין BY-2 סעלז וויזשוואַלייזד אין דעם בייַזייַן פון GFP-ABD2.BY-2 סעלז באהאנדלט מיט KAND 11 (50 μM אָדער 100 μM) אָדער DMSO זענען יגזאַמאַנד דורך קאַנפאָקאַל מיקראָסקאָפּי.די געדיכטקייַט פון קאָרטיקאַל אַקטין פילאַמאַנץ איז קאַלקיאַלייטיד פון מיקראָגראַפס פון 25 פרייַ סעלז.אותיות אָנווייַזן באַטייטיק דיפעראַנסיז (Tukey HSD פּרובירן, ז<0.05).וואָג באַר = 10 μם.(C) אָבסערוואַציע פון ​​טויט BY-2 סעלז דורך עוואַנס בלוי סטיינינג.BY-2 סעלז באהאנדלט מיט KAND 11 (50 μM אָדער 100 μM) אָדער DMSO זענען יגזאַמאַנד דורך העל-פעלד מיקראָסקאָפּי.n=3.וואָג באַר = 100 μם.
די ופדעקונג און אַפּלאַקיישאַן פון נייַע נאַטירלעך פּראָדוקטן האט געפֿירט צו באַטייַטיק אַדוואַנסיז אין פאַרשידן אַספּעקץ פון מענטשלעך לעבן, אַרייַנגערעכנט מעדיצין און אַגריקולטורע.היסטאָרישע פאָרשונג איז דורכגעקאָכט צו באַקומען נוציק קאַמפּאַונדז פון נאַטירלעך רעסורסן.אין באַזונדער, אַקטינאָמיסעטעס זענען באַוווסט צו זיין נוציק ווי אַנטיפּאַראַסיטיק אַנטיביאַטיקס פֿאַר נעמאַטאָודז רעכט צו זייער פיייקייט צו פּראָדוצירן פאַרשידן צווייטיק מעטאַבאָליטעס אַזאַ ווי אַווערמעקטין, די הויפּט קאַמפּאַונד פון יווערמעקטין און בלעאָמיסין און זייַן דעריוואַטיווז, געניצט מעדיסינאַללי ווי אַן אַנטיקאַנסער אַגענט21,22.פּונקט אַזוי, אַ פאַרשיידנקייַט פון הערביסידאַל קאַמפּאַונדז זענען דיסקאַווערד פון אַקטינאָמיסעטעס, עטלעכע פון ​​וואָס זענען שוין קאַמערשאַלי געניצט 1,23.דעריבער, די אַנאַליסיס פון אַקטינאָמיסעטע מעטאַבאָליטעס צו יזאָלירן נאַטירלעך פּראָדוקטן מיט די געבעטן בייאַלאַדזשיקאַל אַקטיוויטעטן איז געהאלטן אַ עפעקטיוו סטראַטעגיע.אין דעם לערנען, מיר דיסקאַווערד אַ נייַע קאַמפּאַונד, קאָומאַמאָנאַמידע, פֿון S. werraensis און הצלחה סינטאַסייזד עס.ורסאָניק זויער איז אַ סינטעטיש ינטערמידייט פון ורבענאַמידע און זייַן דעריוואַטיווז.עס קענען אָנמאַכן כאַראַקטעריסטיש וואָרצל קערלינג, ויסשטעלונג מעסיק צו שטאַרק הערביסידאַל טעטיקייט און גלייַך אָדער מינאַצאַד שעדיקן פאַבריק מיקראָטובולעס.אָבער, די מעקאַניזאַם פון קאַמף פון ורמאָטאָניק זויער קען זיין אַנדערש פון די פון יגזיסטינג מיקראָטובולע ​​ינכיבאַטערז, זינט KAND 11 אויך דיסראַפּץ אַקטין פילאַמאַנץ און ז צעל טויט, סאַגדזשעסטינג אַ רעגולאַטאָרי מעקאַניזאַם דורך וואָס ורמאָטאָניק זויער און זייַן דעריוואַטיווז ימפּלאַמענאַד אַ ברייט קייט פון סיטאָסקעלעטאַל סטראַקטשערז..
ווייַטער דיטיילד קעראַקטעריסטיקס פון ורבענאָניק זויער וועט העלפֿן צו בעסער פֿאַרשטיין די מעקאַניזאַם פון קאַמף פון ורבענאָניק זויער.אין באַזונדער, דער ווייַטער ציל איז צו אָפּשאַצן די פיייקייט פון ורסאָניק זויער צו בינדן צו רידוסט מיקראָטובולעס צו באַשליסן צי ורסאָניק זויער און זייַן דעריוואַטיווז אַקט גלייַך אויף מיקראָטובולעס און דעפּאָלימערייז זיי, אָדער צי זייער קאַמף רעזולטאטן אין מיקראָטובולע ​​דיסטייבאַלאַזיישאַן.אין אַדישאַן, אין דעם פאַל ווען מיקראָטובולעס זענען נישט אַ דירעקט ציל, די ידענטיפיצירן די פּלאַץ פון קאַמף און מאָלעקולאַר טאַרגאַץ פון ורסאָניק זויער אויף פאַבריק סעלז וועט העלפֿן צו פֿאַרשטיין די פּראָפּערטיעס פון פֿאַרבונדענע קאַמפּאַונדז און מעגלעך וועגן צו פֿאַרבעסערן הערביסידאַל טעטיקייט.אונדזער ביאָאַקטיוויטי אַסיי אנטפלעקט די יינציק סיטאָטאָקסיק פיייקייט פון ורסאָניק זויער אויף דעם וווּקס פון געוויקסן אַזאַ ווי אַראַבידאָפּסיס טהאַליאַנאַ, טאַביק און לעבערוואָרט, בשעת ניט E. קאָלי אדער העלאַ סעלז זענען אַפעקטאַד.קליין אָדער קיין טאַקסיסאַטי צו כייַע סעלז איז אַ מייַלע פון ​​ורסאָניק זויער דעריוואַטיווז אויב זיי זענען דעוועלאָפּעד ווי הערביסיידז פֿאַר נוצן אין עפענען לאַנדווירטשאַפטלעך פעלדער.טאַקע, זינט מיקראָטובולעס זענען פּראָסט סטראַקטשערז אין עוקאַריאָטעס, זייער סעלעקטיוו ינאַבישאַן אין געוויקסן איז אַ שליסל פאָדערונג פֿאַר הערביסיידז.פֿאַר בייַשפּיל, פּראָפּיזאַמידע, אַ מיקראָטובולע ​​דעפּאָלימערייזינג אַגענט וואָס גלייך ביינדז צו טובולין און ינכיבאַץ פּאַלימעראַזיישאַן, איז געניצט ווי אַ הערביסידע רעכט צו זיין נידעריק טאַקסיסאַטי צו כייַע סעלז.אין קאַנטראַסט צו דיסאָפּיראַמידע, פֿאַרבונדענע בענזאַמידעס האָבן פאַרשידענע ציל ספּעסיפיקאַטיז.אין אַדישאַן צו פאַבריק מיקראָטובולעס, RH-4032 אָדער בענזאָקסאַמאַדע אויך ינכיבאַץ מיקראָטובולעס פון כייַע סעלז אָדער אָאָמיסעטעס ריספּעקטיוולי, און זאַלילאַמידע איז געניצט ווי אַ פאַנדזשאַסייד רעכט צו זיין נידעריק פיטאָטאַקסיסיטי25,26,27.די ניי דיסקאַווערד בער און זייַן דעריוואַטיווז ויסשטעלונג סעלעקטיוו סיטאָאָקסיסיטי קעגן געוויקסן, אָבער עס איז כדאי צו באמערקן אַז ווייַטער מאָדיפיקאַטיאָנס קען טוישן זייער ציל ספּעסיפיסיטי, פּאַטענטשאַלי צושטעלן נאָך דעריוואַטיווז פֿאַר די קאָנטראָל פון פּאַטאַדזשעניק פונגי אָדער אָאָמיסעטעס.
די יינציק פּראָפּערטיעס פון ורבענאָניק זויער און זייַן דעריוואַטיווז זענען נוציק פֿאַר זייער אַנטוויקלונג ווי הערביסיידז און נוצן ווי פאָרשונג מכשירים.די וויכטיקייט פון די סיטאָסקעלעטאָן אין קאַנטראָולינג פאַבריק צעל פאָרעם איז וויידלי דערקענט.פריער שטודיום האָבן געוויזן אַז געוויקסן האָבן יוואַלווד קאָמפּלעקס מעקאַניזאַמז פון קאָרטיקאַל מיקראָטובולע ​​אָרגאַניזאַציע דורך קאַנטראָולינג מיקראָטובולע ​​דינאַמיק צו רעכט קאָנטראָלירן מאָרפאָגענעסיס.א גרויס נומער פון מאַלאַקיולז פאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר די רעגולירן פון מיקראָטובולע ​​טעטיקייט האָבן שוין יידענאַפייד, און פֿאַרבונדענע פאָרשונג איז נאָך אָנגאָינג3,4,28.אונדזער קראַנט פארשטאנד פון מיקראָטובולע ​​דינאַמיק אין פאַבריק סעלז קען נישט גאָר דערקלערן די מעקאַניזאַמז פון קאָרטיקאַל מיקראָטובולע ​​אָרגאַניזאַציע.פֿאַר בייַשפּיל, כאָטש ביידע דיסאָפּיראַמידע און אָריזאַלין קענען דעפּאָלימערייז מיקראָטובולעס, דיסאָפּיראַמידע ז שטרענג וואָרצל דיסטאָרשאַן בשעת אָריזאַלין האט אַ לעפיערעך מילד ווירקונג.דערצו, מיוטיישאַנז אין טובולין, וואָס סטייבאַלייז מיקראָטובולעס, אויך פאַרשאַפן דעקסטראָראָטאַטיאָן אין רוץ, כוועראַז פּאַקליטאַקסעל, וואָס אויך סטייבאַלייזיז מיקראָטובולע ​​דינאַמיק, טוט נישט.דעריבער, לערנען און ידענטיפיצירן די מאָלעקולאַר טאַרגאַץ פון ורסאָליק זויער זאָל צושטעלן נייַע ינסייץ אין די רעגולירן פון פאַבריק קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס.פּונקט אַזוי, צוקונפֿט קאַמפּעראַסאַנז פון קעמיקאַלז וואָס זענען עפעקטיוו אין פּראַמאָוטינג פאַרקרימט וווּקס, אַזאַ ווי דיסאָפּיראַמידע, און ווייניקער עפעקטיוו קעמיקאַלז, אַזאַ ווי אָריזאַלין אָדער קומאַמאָטאָריק זויער, וועט צושטעלן קלוז צו ווי פאַרקרימט וווּקס אַקערז.
אויף די אנדערע האַנט, פאַרטיידיקונג-פֿאַרבונדענע סיטאָסקעלעטאַל ריעריינדזשמאַנץ זענען אן אנדער מעגלעכקייט צו דערקלערן די סיטאָטאָקסיסיטי פון ורסאָניק זויער.ינפעקציע פון ​​​​אַ פּאַטאַדזשאַן אָדער הקדמה פון אַן עליסיטאָר אין פאַבריק סעלז מאל ז צעשטערונג פון די סיטאָסקעלעטאָן און סאַבסאַקוואַנט צעל טויט29.צום ביישפּיל, קריפּטאָקסאַנטהין פון אָאָמיסעטע איז רעפּאָרטעד צו צעשטערן מיקראָטובולעס און אַקטין פילאַמאַנץ איידער טאַביק צעל טויט, ענלעך צו וואָס אַקערז מיט KAND באַהאַנדלונג30,31.די סימאַלעראַטיז צווישן פאַרטיידיקונג רעספּאָנסעס און סעליאַלער רעספּאָנסעס ינדוסט דורך ורסאָניק זויער געפירט אונדז צו כייפּאַטאַסייזד אַז זיי צינגל פּראָסט סעליאַלער פּראַסעסאַז, כאָטש אַ פאַסטער און שטארקער ווירקונג פון ורסאָניק זויער ווי קריפּטאָקסאַנטהין איז קענטיק.אָבער, שטודיום האָבן געוויזן אַז דיסראַפּשאַן פון אַקטין פילאַמאַנץ פּראַמאָוץ ספּאַנטייניאַס צעל טויט, וואָס איז ניט שטענדיק באגלייט דורך מיקראָטובולע ​​דיסראַפּשאַן29.אין אַדישאַן, עס בלייבט צו זען צי דער פּאַטאַדזשאַן אָדער די יליסיטאָר זייַנען פאַרקרימט וואָרצל וווּקס, ווי ורסאָניק זויער דעריוואַטיווז טאָן.אזוי, מאָלעקולאַר וויסן פֿאַרבינדונג פאַרטיידיקונג רעספּאָנסעס און די סיטאָסקעלעטאָן איז אַ אַטראַקטיוו פּראָבלעם צו זיין גערעדט.דורך עקספּלויטינג דעם בייַזייַן פון נידעריק מאָלעקולאַר וואָג קאַמפּאַונדז שייַכות צו ורסאָניק זויער, ווי געזונט ווי אַ קייט פון דעריוואַטיווז מיט וועריינג פּאָוטאַנסיז, זיי קען צושטעלן אַפּערטונאַטיז צו ציל אומבאַקאַנט סעליאַלער מעקאַניזאַמז.
צוזאַמען, די ופדעקונג און אַפּלאַקיישאַן פון נייַע קאַמפּאַונדז וואָס מאָדולירן מיקראָטובולע ​​דינאַמיק וועט צושטעלן שטאַרק מעטהאָדס צו אַדרעס די קאָמפּלעקס מאָלעקולאַר מעקאַניזאַמז אַנדערלייינג פאַבריק צעל פאָרעם פעסטקייַט.אין דעם קאָנטעקסט, די לעצטנס דעוועלאָפּעד קאַמפּאַונד ורמאָטאָניק זויער, וואָס אַפעקץ מיקראָטובולעס און אַקטין פילאַמאַנץ און ינדוסיז צעל טויט, קען צושטעלן אַ געלעגנהייט צו דיסייפער די קשר צווישן מיקראָטובולע ​​קאָנטראָל און די אנדערע מעקאַניזאַמז.אזוי, כעמישער און בייאַלאַדזשיקאַל אַנאַליסיס ניצן ורבענאָניק זויער וועט העלפֿן אונדז פֿאַרשטיין די מאָלעקולאַר רעגולאַטאָרי מעקאַניזאַמז וואָס קאָנטראָלירן די פאַבריק סיטאָסקעלעטאָן.
ינאָקולירן S. werraensis MK493-CF1 אין אַ 500 מל באַפפלעד ערלענמייער קאָלבע מיט 110 מל פון זוימען מיטל קאַנסיסטינג פון 2% (וו / וו) גאַלאַקטאָסע, 2% (וו / וו) עסאַנס פּאַפּ, 1% (וו / וו) באַקטאָ זאַץ .-סאָיטאָן (טהערמאָ פישער וויסנשאפטלעכע, ינק.), 0.5% (וו / וו) פּאַפּשוי עקסטראַקט (KOGOSTCH קאָו, לטד, יאַפּאַן), 0.2% (וו / וו) (נה 4) 2סאָ 4 און 0.2% קאַקאָ 3 אין דייאַנייזד וואַסער.(pH 7.4 איידער סטעראַליזיישאַן).די זוימען קאַלטשערז זענען ינקובייטיד אויף אַ דריי-שייקער (180 רפּם) ביי 27 ° C פֿאַר 2 טעג.פּראָדוקציע קאַלטיוויישאַן דורך האַרט שטאַט פערמאַנטיישאַן.די זוימען קולטור (7 מל) איז טראַנספערד אין אַ 500 מל ק-1 קאָלבע מיט 40 ג פון פּראָדוקציע מיטל קאַנסיסטינג פון 15 ג פון געדריקט גערשטן (MUSO קאָו, לטד, יאַפּאַן) און 25 ג פון דייאַנייזד וואַסער (פּה ניט אַדזשאַסטיד) איידער סטעראַליזיישאַן).).פערמאַנטיישאַן איז געפירט אויס בייַ 30 ° C אין דער פינצטער פֿאַר 14 טעג.די פערמאַנטיישאַן מאַטעריאַל איז יקסטראַקטיד מיט 40 מל / פלאַש עטאָה און סענטריפוגעד (1500 ג, 4 ° C, 10 מין).די קולטור סופּערנאַנטאַנט (60 מל) איז יקסטראַקטיד מיט אַ געמיש פון 10% מעאָה / עטאָאַק.די אָרגאַניק שיכטע איז יוואַפּערייטיד אונטער רידוסט דרוק צו באַקומען אַ רעזאַדו (59.5 מג), וואָס איז געווען אונטערטעניק צו HPLC מיט גראַדיענט ילושאַן (0-10 מינוט: 90%) אויף אַ פאַרקערט פאַסע זייַל (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 מם × לענג 250 מם) H2O/CH3CN, 10-35 מינוט: 90% H2O/CH3CN צו 70% H2O/CH3CN (גראַדיענט), 35-45 מינוט: 90% H2O/EtOH, 45-155 מינוט: 90% H2O / עטאָה צו 100% עטאָה (גראַדיענט (גראַדייענט), 155-200 מין: 100% עטאָה) אין אַ לויפן קורס פון 1.5 מל / מין, קאָומאַמאָנאַמידע (1, 36.0 מג) איז אפגעזונדערט ווי אַ ווייַס אַמאָרפאַס פּודער.
קומאַמאָטאָאַמידע (קסנומקס);1H-NMR (500 מהז, CDCl3) δ 6.93 (ה, דזש = 2.5 הז, 1 ה), 6.76 (דד, דזש = 4.3, 1.8 הז 1 ה), 6.05 (ה, דזש = 3.8 הז, 1 ה).), 4.08 (s, 3 ה);13ק-נמר (125 מהז, קדקל3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ קאַלקיאַלייטיד ווערט: 141.0659, געמאסטן ווערט: 141.0663, יר νמאַקס 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593 סענטימעטער–15.
קאָלאָמביע זאמען (Col-0) זענען באקומען פון די אַראַבידאָפּסיס ביאָלאָגיקאַל ריסאָרס צענטער (ABRC) מיט דערלויבעניש פֿאַר פאָרשונג נוצן.קאָל-0 זאמען זענען פּראַפּאַגייטיד און מיינטיינד אונטער אונדזער לאַבאָראַטאָריע טנאָים און געוויינט ווי ווילד-טיפּ אַראַבידאָפּסיס געוויקסן.אַראַבידאָפּסיס זאמען זענען ייבערפלאַך סטעראַלייזד און קאַלטשערייזד אין האַלב-שטאַרקייַט Murashige און Skoog מיטל מיט 2% סוקראָוס (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (וו / וו) 2-(4-מאָרפאָלינאָ) עטהאַנעסולפאָניק זויער (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) און 1.5% אַגאַר (פודזשיפילם וואַקאָ פּורע כעמישער), ף 5.7, ביי 23 °C און קעסיידערדיק ליכט.סעעדס פון די phs1-1 מוטאַנט זענען צוגעשטעלט דורך טי האַשימאָטאָ (נאַראַ אינסטיטוט פון וויסנשאַפֿט און טעכנאָלאָגיע).
זאמען פון שפּאַנונג SR-1 זענען צוגעשטעלט דורך טי האַשימאָטאָ (נאַראַ אינסטיטוט פון וויסנשאַפֿט און טעכנאָלאָגיע) און געוויינט ווי ווילד-טיפּ טאַביק געוויקסן.טאַביק זאמען זענען סטעראַלייזד אויף די ייבערפלאַך און סאָוקט אין סטערילע וואַסער פֿאַר דריי נעכט צו העכערן דזשערמאַניישאַן, דערנאָך געשטעלט אין אַ האַלב-שטאַרקייַט לייזונג מיט 2% סוקראָוס, 0.05% (וו / וו) MES און 0.8% געלאַן גומע (Fujifilm Wako Pure Chemical) מוראַשיגע.און סקאָאָג מיטל) מיט ף 5.7 און ינקובייטיד ביי 23 ° C אונטער קעסיידערדיק ליכט.
שפּאַנונג טאַק-1 איז געווען צוגעשטעלט דורך טי קאָהטשי (קיאָטאָ אוניווערסיטעט) און איז געניצט ווי דער נאָרמאַל יקספּערמענאַל אַפּאַראַט פֿאַר די לעבערוואָרט לערנען.געמאַ איז באקומען פון סטעראַלייזד געבילדעטער געוויקסן און דעמאָלט פּלייטאַד אויף Gamborg B5 מיטל (Fujifilm Wako Pure Chemical) מיט 1% סוקראָוס און 0.3% געלאַן גומע און ינקובייטיד ביי 23 ° C אונטער קעסיידערדיק ליכט.
טאַביק BY-2 סעלז (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) זענען צוגעשטעלט דורך S. Hasezawa (אוניווערסיטעט פון טאָקיאָ).BY-2 סעלז זענען דיילוטאַד 95-פאַרלייגן אין מאַדאַפייד לינסמעיער און סקאָאָג מיטל און סאַפּלאַמענטאַד וויקלי מיט 2,4-דיטשלאָראָפענאָקסיאַסעטיק זויער 32.דער צעל סאַספּענשאַן איז געמישט אויף אַ דריי-שייקער ביי 130 רפּם ביי 27 ° C אין דער פינצטער.וואַשן סעלז מיט 10 מאל די באַנד פון פריש מיטל און רעסאַספּענשאַן אין דער זעלביקער מיטל.BY-2 טראַנסגעניק צעל שורות סטאַביל יקספּרעסינג די מיקראָטובולע ​​מאַרקער TagRFP-TUA6 אָדער די אַקטין פאָדעם מאַרקער GFP-ABD2 אונטער די בלומענקרויט מאָסאַיק ווירוס 35S פּראָמאָטער זענען דזשענערייטאַד ווי דיסקרייבד 33,34,35.די צעל שורות קענען זיין מיינטיינד און סינגקראַנייזד ניצן פּראָוסידזשערז ענלעך צו די געניצט פֿאַר דער אָריגינעל BY-2 צעל ליניע.
HeLa סעלז זענען קאַלטשערד אין Dulbecco ס מאַדאַפייד יגאַל ס מיטל (DMEM) (לעבן טעטשנאָלאָגיעס) סאַפּלאַמענטאַד מיט 10% פיטאַל באָווין סערום, 1.2 ו / מל פּעניסיללין און 1.2 μג / מל סטרעפּטאָמיסין אין אַ 37 ° C ינגקיאַבייטער מיט 5% CO2.
אַלע יקספּעראַמאַנץ דיסקרייבד אין דעם מאַנוסקריפּט זענען דורכגעקאָכט אין לויט מיט יאַפּאַניש ביאָסאַפעטי רעגיאַליישאַנז און גיידליינז.
קאַמפּאַונדז זענען צעלאָזן אין דימעטהיל סולפאָקסידע (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ווי לאַגער סאַלושאַנז און דיילוטאַד אין מיז מיטל פֿאַר אַראַבידאָפּסיס און טאַביק אָדער גאַמבאָרג ב 5 מיטל פֿאַר לעבערוואָרט.פֿאַר די שורש גראָוט ינאַבישאַן אַסייַ, מער ווי 10 זאמען פּער טעלער זענען סאָון אויף אַגאַר מיטל מיט די אנגעוויזן קאַמפּאַונדז אָדער DMSO.זאמען זענען ינגקיובייטיד אין אַ גראָוט קאַמער פֿאַר 7 טעג.די סידלינגז זענען פאָוטאַגראַפט און די לענג פון די וואָרצל איז געמאסטן.פֿאַר אַראַבידאָפּסיס דזשערמאַניישאַן אַססייַ, 48 זאמען פּער טעלער זענען סאָון אויף אַגאַר מיטל מיט 200 μM קאַמפּאַונד אָדער דמסאָ.אַראַבידאָפּסיס זאמען זענען דערוואַקסן אין אַ וווּקס קאַמער און די נומער פון דזשערמאַנייטיד סידלינגז איז גערעכנט 7 טעג נאָך דזשערמאַניישאַן (טאָג).פֿאַר טאַביק דזשערמאַניישאַן אַססייַ, 24 זאמען פּער טעלער זענען סאָון אויף אַגאַר מיטל מיט 200 μM KAND אָדער DMSO.טאַביק זאמען זענען דערוואַקסן אין אַ וווּקס קאַמער און די נומער פון דזשערמאַנייטיד סידלינגז איז גערעכנט נאָך 14 טעג.פֿאַר די לעבערוואָרט גראָוט ינאַבישאַן אַסייַ, 9 עמבריאָוז פון יעדער טעלער זענען פּלייטאַד אויף אַגאַר מיטל מיט די אנגעוויזן קאַנסאַנטריישאַנז פון KAND אָדער DMSO און ינקובייטיד אין אַ וווּקס קאַמער פֿאַר 14 טעג.
ניצן סידלינגז סטיינד מיט 5 מג / מל פּראָפּידיום יאָדידע (פּי) צו וויזשוואַלייז וואָרצל מעריסטעם אָרגאַניזאַציע.פּי סיגנאַלז זענען באמערקט דורך פלואָרעססענסע מיקראָסקאָפּי ניצן אַ TCS SPE קאָנפאָקאַל לאַזער סקאַנינג מיקראָסקאָפּ (Leica Microsystems).
היסטאָטשעמיקאַל סטיינינג פון רוץ מיט β-גלוקוראָנידאַסע (GUS) איז דורכגעקאָכט לויט די פּראָטאָקאָל דיסקרייבד דורך Malami און Benfey36.סידלינגז זענען פאַרפעסטיקט אין 90% אַסאַטאָון יבערנאַכטיק, סטיינד מיט 0.5 מג / מל 5-בראָמאָ-4-טשלאָראָ-3-ינדאָליל-β-ד-גלוקוראָניק זויער אין GUS באַפער פֿאַר 1 שעה און געשטעלט אין אַ כיידרייטאַד טשלאָראַלדעכייד לייזונג.(8 ג טשלאָראַל כיידרייט, 2 מל וואַסער און 1 מל גליסעראָל) און באמערקט דורך דיפערענטשאַל ינטערפיראַנס קאַנטראַסט מיקראָסקאָפּי ניצן אַ Axio Imager M1 מיקראָסקאָפּ (Carl Zeiss).
וואָרצל אַנגלעס זענען געמאסטן אויף 7-טאָג-אַלט סידלינגז דערוואַקסן אויף ווערטיקלי געשטעלט פּלאַטעס.מעסטן די ווינקל פון דער וואָרצל פֿון דער ריכטונג פון דער ערלעכקייט וועקטאָר ווי דיסקרייבד אין שריט 6.
די אָרדענונג פון קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס איז באמערקט ווי דיסקרייבד, מיט מינערווערטיק מאָדיפיקאַטיאָנס צו די פּראָטאָקאָל 37.אַנטי-β-טובולין אַנטיבאָדי (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) און Alexa Fluor 488-conjugated anti-mause IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) זענען געניצט ווי ערשטיק און צווייטיק אַנטיבאָדיעס אין 1:1000 און 1:100 דילושאַנז, ריספּעקטיוולי.פלואָרעססענסע בילדער זענען קונה מיט אַ TCS SPE קאַנפאָקאַל לאַזער סקאַנינג מיקראָסקאָפּ (Leica Microsystems).קריגן ז-סטאַק בילדער און מאַכן פּראַדזשעקשאַנז פון מאַקסימום ינטענסיטי לויט די ינסטראַקשאַנז פון דער פאַבריקאַנט.
HeLa צעל פּראָוליפעריישאַן אַססייַ איז דורכגעקאָכט מיט צעל קאַונטינג קיט 8 (דאָדזשינדאָ) לויט די ינסטראַקשאַנז פון דער פאַבריקאַנט.
דער וווּקס פון E. coli DH5α איז אַנאַלייזד דורך מעסטן צעל געדיכטקייַט אין קולטור ניצן אַ ספּעקטראָפאָטאָמעטער ביי 600 נם (OD600).
סיטאָסקעלעטאַל אָרגאַניזאַציע אין טראַנסגעניק BY-2 סעלז איז באמערקט מיט אַ פלורעסאַנס מיקראָסקאָפּ יקוויפּט מיט אַ CSU-X1 קאַנפאָקאַל סקאַנינג מיטל (Yokogawa) און אַ sCMOS אַפּאַראַט (Zyla, Andor Technology).סיטאָסקעלעטאַל געדיכטקייַט איז אַססעססעד דורך בילד אַנאַליסיס, וואָס קוואַנטאַפייד די פּראָצענט פון סיטאָסקעלעטאַל בילדצעלן צווישן סיטאָפּלאַסמיק בילדצעלן אין קאָנפאָקאַל בילדער ניצן ImageJ ווייכווארג ווי דיסקרייבד38,39.
צו דעטעקט צעל טויט אין BY-2 סעלז, אַן אַליקוואָט פון די צעל סאַספּענשאַן איז ינקובייטיד מיט 0.05% עוואַנס בלוי פֿאַר 10 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.סעלעקטיוו עוואַנס בלוי סטיינינג פון טויט סעלז דעפּענדס אויף יקסטרוזשאַן פון די פאַרב פון ווייאַבאַל סעלז דורך די בעשאָלעם פּלאַזמע מעמבראַנע40.סטיינד סעלז זענען באמערקט מיט אַ העל-פעלד מיקראָסקאָפּ (BX53, Olympus).
HeLa סעלז זענען דערוואַקסן אין DMEM סאַפּלאַמענטאַד מיט 10% FBS אין אַ כיומידיד ינגקיאַבייטער ביי 37 ° C און 5% CO2.סעלז זענען באהאנדלט מיט 100 μM KAND 11, קומאַמאָנאַמיק זויער 6, קומאַמאָנאַמידע 1, 100 נג / מל קאָלסעמיד (גיבקאָ), אָדער 100 נג / מל נאָקאָדמאַזע (סיגמאַ) פֿאַר 6 שעה ביי 37 ° סי.סעלז זענען פאַרפעסטיקט מיט מעטאָה פֿאַר 10 מינוט און דעמאָלט מיט אַסאַטייט פֿאַר 5 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.פאַרפעסטיקט סעלז זענען ינקובייטיד מיט β-טובולין ערשטיק אַנטיבאָדי (1D4A4, פּראָטעינטעטש: 66240-1) דיילוטאַד אין 0.5% BSA / PBS פֿאַר 2 שעה, געוואשן 3 מאל מיט טבסט, און דעמאָלט ינקובייטיד מיט Alexa Fluor ציגעלע אַנטיבאָדי.488 1 שעה.- מאַוס יגג (טהערמאָ פישער וויסנשאפטלעכע: אַ11001) און 15 נג / מל 4′,6-דיאַמינאָ-2-פענילינדאָל (דאַפּי) דיילוטאַד אין 0.5% בסאַ / פּבס.נאָך וואַשינג מיט טבסט דריי מאָל, סטיינד סעלז זענען באמערקט אויף אַ Nikon Eclipse Ti-E ינווערטיד מיקראָסקאָפּ.בילדער זענען קאַפּטשערד מיט אַ קולד Hamamatsu ORCA-R2 CCD אַפּאַראַט ניצן MetaMorph ווייכווארג (מאָלעקולאַר דעוויסעס).