ופדעקונג, כאַראַקטעריזאַציע און פאַנגקשאַנאַל פֿאַרבעסערונג פון אורסאַ מאָנאָאַמידעס ווי נייַע פלאַנצן וווּקס ינכיבאַטאָרס וואָס ווירקן פלאַנצן מיקראָטובולעס.

א דאנק פארן באזוכן Nature.com. די ווערסיע פון ​​בראַוזער וואָס איר ניצט האט באַגרענעצטע CSS שטיצע. פֿאַר די בעסטע רעזולטאַטן, רעקאָמענדירן מיר אַז איר זאָלט ניצן אַ נייערע ווערסיע פון ​​אייער בראַוזער (אָדער דיאַקטיווירן קאָמפּאַטיביליטי מאָדע אין אינטערנעט עקספּלאָרער). אין דער דערווייל, צו זיכער מאַכן אָנגייענדיקע שטיצע, ווייַזן מיר דעם וועבזייטל אָן סטיילינג אָדער דזשאַוואַסקריפּט.
די אנטדעקונג און נוצבארע באַניץ פון נאַטירלעכע פּראָדוקטן קען העלפֿן פֿאַרבעסערן מענטשלעכן לעבן. פלאַנצן וואוקס אינהיביטאָרישע כעמיקאַלן ווערן ברייט גענוצט ווי הערביצידן צו קאָנטראָלירן ווידז. צוליב דעם נויטווענדיקייט צו נוצן פֿאַרשידענע טיפּן הערביצידן, איז דאָ אַ נויטווענדיקייט צו ידענטיפֿיצירן קאַמפּאַונדז מיט נייע מעכאַניזמען פון קאַמף. אין דעם לערנען, האָבן מיר אַנטדעקט אַ נייַע N-אַלקאָקסיפּיראָל קאַמפּאַונד, קומאַמאָנאַמיד, פֿון Streptomyces werraensis MK493-CF1 און געגרינדעט דעם גאַנצן סינטעז פּראָצעס. דורך ביאָלאָגישע טעטיקייט אַסייז, האָבן מיר אַנטדעקט אַז urs-מאָנאָאַמיק זויער איז אַ סינטעטישער אינטערמידייט פון urs-מאָנאָאַמיד און אַ פּאָטענציעל...פלאַנצן וווּקס ינכיבאַטאָרדערצו, האבן מיר אנטוויקלט פארשידענע אורבענאנישע זויער דעריוואטן, אריינגערעכנט די אורבענילאקסי דעריוואט (UDA), וואס האט הויכע הערביצידע טעטיקייט אן נעגאטיוו צו באאיינפלוסן דעם וואוקס פון HeLa צעלן. מיר האבן אויך געפונען אז אורמאטאנישע זויער דעריוואטן שטערן פלאנץ מיקראטובולעס; דערצו, KAND באאיינפלוסט אקטין פילאמענטן און אינדוצירט צעל טויט; די פארשידענארטיגע ווירקונגען זענען אנדערש פון די פון באקאנטע מיקראטובול אינהיביטארן און סאגדזשעסטירן א נייעם מעכאניזם פון אקציע פאר אורסאנישע זויער, וואס רעפרעזענטירט א וויכטיגן פארטייל אין דער אנטוויקלונג פון נייע הערביצידן.
די אנטדעקונג און פּראַקטישע אָנווענדונג פון נוצלעכע נאַטירלעכע פּראָדוקטן און זייערע דעריוואַטיוון איז אַ מיטל צו פֿאַרבעסערן די קוואַליטעט פון מענטשלעך לעבן. צווייטיקע מעטאַבאָליטן פּראָדוצירט דורך מיקראָאָרגאַניזמען, געוויקסן און ינסעקטן האָבן געפֿירט צו גרויסע פֿאָרשריטן אין מעדיצין און לאַנדווירטשאַפט. פילע אַנטיביאָטיקס און אַנטי-לוקימיאַ מעדאַקאַמענטן זענען דעוועלאָפּעד געוואָרן פֿון נאַטירלעכע פּראָדוקטן. אין דערצו, פֿאַרשידענע טיפּן פוןפּעסטאַצידן, פונגיצידן און הערביצידן ווערן עקסטראַקטירט פון די נאַטירלעכע פּראָדוקטן פֿאַר נוצן אין לאַנדווירטשאַפט. אין באַזונדער, וויד קאָנטראָל הערביצידן זענען וויכטיקע מכשירים פֿאַר פאַרגרעסערן גערעטעניש ייעלדס אין מאָדערן לאַנדווירטשאַפט, און פאַרשידענע טייפּס פון קאַמפּאַונדז זענען שוין געניצט קאמערשעל. עטלעכע צעלולאַרע פּראַסעסאַז אין געוויקסן, אַזאַ ווי פאָטאָסינטעז, אַמינאָ זויער מעטאַבאָליזאַם, צעל וואַנט סינטעז, רעגולירן פון מיטאָזיס, פיטאָכאָרמאָון סיגנאַלינג, אָדער פּראָטעין סינטעז, ווערן באַטראַכט ווי טיפּיש צילן פון הערביצידן. קאַמפּאַונדז וואָס ינכיבאַט מיקראָטובולע ​​פונקציע זענען אַ פּראָסט קלאַס פון הערביצידן וואָס ווירקן פלאַנצן וווּקס דורך ווירקן מיטאָטיק רעגולאַציע2.
מיקראָטובולעס זענען קאָמפּאָנענטן פון די ציטאָסקעלעטאָן און זענען ברייט קאָנסערווירט אין עוקאַריאָטיש צעלן. דער טובולין העטעראָדימער באַשטייט פון α-טובולין און β-טובולין, וואָס שאַפן לינעאַרע מיקראָטובול פּראָטאָפילאַמענץ, מיט 13 פּראָטאָפילאַמענץ וואָס שאַפן אַ צילינדרישע סטרוקטור. מיקראָטובולעס שפּילן קייפל ראָלעס אין פלאַנצן צעלן, אַרייַנגערעכנט באַשטימען צעל פאָרעם, צעל טיילונג, און ינטראַסעלולאַר טראַנספּאָרט3,4. פלאַנצן צעלן אַנטהאַלטן מיקראָטובולעס אונטער די ינטערפאַסע פּלאַזמע מעמבראַנע, און די אַזוי גערופענע קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס ווערן געדאַנק צו קאָנטראָלירן די אָרגאַניזאַציע פון ​​צעלולאָז מיקראָפיברילס דורך די רעגולאַציע פון ​​צעלולאָז סינטהאַסע קאָמפּלעקסן4,5. קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס פון וואָרצל עפּידערמאַל צעלן, פאָרשטעלן אין דער זאָנע פון ​​שנעלער פֿאַרלענגערונג פון די וואָרצל שפּיץ, זענען ליגן לאַטעראַל, און צעלולאָז מיקראָפייבערס נאָכפאָלגן די מיקראָטובולעס און באַגרענעצן די ריכטונג פון צעל יקספּאַנשאַן, דערמיט פּראָמאָטינג אַניסאָטראָפּיק צעל פֿאַרלענגערונג. דעריבער, מיקראָטובולע ​​פונקציע איז ענג פֿאַרבונדן מיט פלאַנצן מאָרפאָלאָגיע. אַמינאָ זויער סאַבסטיטוציעס אין גענעס וואָס קאָדירן טובולין פאַראורזאַכן אַ סקיו פון קאָרטיקאַל מיקראָטובול אַררעיס און לינקס- אָדער רעכטס-זייַטיק וווּקס אין אַראַבידאָפּסיס 6,7. ענלעך, מוטאַציעס אין מיקראָטובול-פֿאַרבונדענע פּראָטעינס וואָס רעגולירן מיקראָטובול דינאַמיק קענען אויך פירן צו פאַרקרימט וואָרצל וווּקס 8,9,10,11,12,13. אין אַדישאַן, באַהאַנדלונג מיט מיקראָטובול-דיסראַפּטינג הערביסיידז אַזאַ ווי דיסאָפּיראַמיד, אויך באַקאַנט ווי פּרעטילאַטשלאָר, פאַראורזאַכט אויך לינקס-זייַטיק אָבליק וואָרצל וווּקס 14. די דאַטן ווייַזן אַז פּינקטלעך רעגולירן פון מיקראָטובול פונקציע איז קריטיש פֿאַר באַשטימען די ריכטונג פון פּלאַנט וווּקס.
פארשידענע טיפן מיקראָטובול אינהיביטאָרן זענען אנטדעקט געוואָרן, און די מעדיקאַמענטן האָבן געמאַכט באַדייטנדיקע ביישטייערונגען צו ציטאָסקעלעטאַלער פאָרשונג, ווי אויך צו לאַנדווירטשאַפט און מעדיצין2. אין באַזונדער, אָריזאַלין, דיניטראָאַנילין קאַמפּאַונדז, דיסאָפּיראַמיד, בענזאַמיד-פֿאַרבונדענע קאַמפּאַונדז, און זייערע אַנאַלאָגן קענען שטערן מיקראָטובול פונקציע און דערמיט שטערן פלאַנצן וווּקס. דעריבער, זיי ווערן וויידלי געניצט ווי הערביצידן. אָבער, זינט מיקראָטובולן זענען אַ וויכטיקער קאָמפּאָנענט פון פלאַנצן און כייַע סעלז, רובֿ מיקראָטובול אינהיביטאָרן זענען ציטאָטאָקסיק צו ביידע צעל טייפּס. דעריבער, טראָץ זייער דערקענט נוצן ווי הערביצידן, אַ לימיטעד נומער פון אַנטימיקראָטובול אגענטן ווערן געניצט פֿאַר פּראַקטישע צוועקן.
Streptomyces איז אַ מין פון דער משפּחה Streptomyces, וואָס כולל אַעראָביק, גראַם-פּאָזיטיוו, פילאַמענטאָוס באַקטעריע און איז ברייט באַקאַנט פֿאַר זיין פיייקייט צו פּראָדוצירן אַ ברייט קייט פון צווייטיק מעטאַבאָליטן. דעריבער, עס איז געהאלטן איינער פון די מערסט וויכטיק קוואלן פון נייַע ביאָלאָגיש אַקטיוו נאַטירלעך פּראָדוקטן. אין דער איצטיקער שטודיע, מיר האָבן אַנטדעקט אַ נייַע קאַמפּאַונד גערופן קומאַמאָנאַמיד, וואָס איז געווען אפגעזונדערט פון Streptomyces werraensis MK493-CF1 און S. werraensis ISP 5486. ניצן ספּעקטראַל אַנאַליסיס און פול ספּעקטראַל אַנאַליסיס, די סטרוקטור פון קומאַמאָנאַמיד איז געווען קעראַקטעריז און זיין יינציק N-אַלקאָקסיפּירראָלע סקעלעט איז געווען באַשטימט. סינטעז. אורסמאָניק זויער, אַ סינטעטיש ינטערמידייט פון אורסמאָנאָאַמיד און זייַן דעריוואַטיווז, איז געפֿונען צו ינכיבאַט די וווּקס און דזשערמאַניישאַן פון די פאָלקס מאָדעל פּלאַנט Arabidopsis thaliana. אין אַ סטרוקטור-אַקטיוויטי באַציִונג שטודיע, מיר געפֿונען אַז אַ קאַמפּאַונד מיט C9 מאָדיפיצירט צו אורסאָניק זויער, גערופן נאָנילאָקסי דעריוואַטיוו פון אורסאָניק זויער (KAND), באַדייטנד ענכאַנסיז די ינכיבאַטאָרי ווירקונג אויף וווּקס און דזשערמאַניישאַן. באַמערקענסווערט, דער ניי-אנטדעקטער פלאַנצן-וואוקס אינהיביטאָר האָט אויך אַפעקטירט דעם וואוקס פון טאַבאַק און לעבערוואָרץ און איז נישט געווען ציטאָטאָקסיש פֿאַר באַקטעריע אָדער HeLa צעלן. דערצו, עטלעכע אורמאָטאָניק זויער דעריוואַטיוון אינדוצירן אַ פאַרדרייטע וואָרצל פענאָטיפּ, וואָס ימפּלייז אַז די דעריוואַטיוון דירעקט אָדער אומדירעקט אַפעקטירן מיקראָטובולעס. אין איינקלאַנג מיט דעם געדאַנק, אונדזערע אָבסערוואַציעס פון מיקראָטובולעס וואָס זענען באַצייכנט אָדער יממונאָכיסטאָכעמיש אָדער מיט פלורעסצענט פּראָטעאינען ווייַזן אַז KAND באַהאַנדלונג דעפּאָלימעריזירט מיקראָטובולעס. אין דערצו, באַהאַנדלונג מיט קומאַטאָניק זויער דעריוואַטיוון צעשטערט אַקטין מיקראָפילאַמענץ. אַזוי, מיר האָבן אַנטדעקט אַ נייעם פלאַנצן-וואוקס אינהיביטאָר וועמענס יינציקער מעקאַניזם פון קאַמף ינוואַלווז צעשטערונג פון די ציטאָסקעלעטאָן.
שטאַם MK493-CF1 איז אפגעזונדערט געוואָרן פֿון באָדן אין שינאַגאַוואַ-קו, טאָקיאָ. שטאַם MK493-CF1 האָט געשאַפֿן אַ גוט-צווייגיקן סטראָמאַלן מיצעליום. די טיילווייזע סיקוואַנס פֿון דעם 16S ריבאָסאָמאַל RNA גען (1422 bp) איז באַשטימט געוואָרן. דער שטאַם איז זייער ענלעך צו S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: טיפּישער שטאַם, 99.93%). באַזירט אויף דעם רעזולטאַט, איז באַשטימט געוואָרן אַז דער שטאַם איז ענג פֿאַרבונדן מיטן טיפּ שטאַם פֿון S. werraensis. דעריבער, האָבן מיר דעם שטאַם פּראָוויזאָריש געגעבן דעם נאָמען S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T פּראָדוצירט אויך די זעלבע ביאָאַקטיווע פֿאַרבינדונגען. ווײַל עס איז געווען ווייניק פֿרי פֿאָרשונג וועגן באַקומען נאַטירלעכע פּראָדוקטן פֿון דעם מיקראָאָרגאַניזם, איז ווײַטערדיקע כעמישע פֿאָרשונג דורכגעפֿירט געוואָרן. נאך קולטיוואציע פון ​​S. werraensis MK493-CF1 אויף גערשטן מעדיום דורך סאליד-סטעיט פערמענטאציע ביי 30°C פאר 14 טעג, איז דער מעדיום עקסטראקטירט געווארן מיט 50% EtOH. 60 מל פון דער מוסטער איז געטריקנט געווארן צו באקומען 59.5 מג פון רויע עקסטראַקט. דער רויע עקסטראַקט איז אונטערגעווארפן געווארן צו ריווערס פאזע HPLC צו געבן N-מעטאקסי-1H-פירראל-2-קארבאקסאמיד (1, גערופן קומאמאנאמיד, 36.0 מג). די גאנצע סומע פון ​​1 איז בערך 60% פון דעם רויע עקסטראַקט. דעריבער, האבן מיר באַשלאָסן צו שטודירן אין דעטאַל די אייגנשאפטן פון קומאמאטאאמיד 1.
קומאמאנאמיד 1 איז א ווייסער אמארפישער פודער און הויך-רעזאלוציע מאסע ספעקטראמעטריע (HRESIMS) באשטעטיגט C6H8N2O2 (פיגור 1). דער C2-סאבסטיטוטירטער פּירראָל פראַגמענט פון דעם קאַמפּאַונד איז כאַראַקטעריזירט דורך δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH אין 1H NMR ספּעקטרום: 4.5 Hz, H-5) און δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), און דער 13C NMR ספּעקטרום ווייזט די אנוועזנהייט פון פיר sp2 טשאַד אַטאָמען. די אנוועזנהייט פון אַן אַמיד גרופּע ביי דער C2 פּאָזיציע איז געווען אַססעססעד דורך HMBC קאָרעלאַציע פון ​​דעם C-3 פּראָטאָן צו דעם אַמיד קאַרבאָניל טשאַד ביי δC 161.1. דערצו, 1H און 13C NMR שפּיצן ביי δH 4.10 (3H, S) און δC 68.3 ווײַזן אויף דער אנוועזנהייט פון N-מעטאקסי גרופּעס אין דער מאָלעקול. כאָטש די ריכטיקע פּאָזיציע פון ​​דער מעטאקסי גרופּע איז נאָך נישט באַשטימט געוואָרן מיט ספּעקטראָסקאָפּישע אַנאַליז ווי למשל ענהאַנסט דיפערענס ספּעקטראָסקאָפּיע און נוקלעאַרע אָוווערהויזער אַבריווייישאַן (NOEDF), איז N-מעטאקסי-1H-פּיראָל-2-קאַרבאָקסאַמיד געוואָרן דער ערשטער קאַנדידאַט קאַמפּאַונד.
כדי צו באַשטימען די ריכטיקע סטרוקטור פון 1, איז דורכגעפירט געוואָרן אַ גאַנצע סינטעז (פיגור 2a). באַהאַנדלונג פון קאמערציעל בנימצא 2-אַמינאָפּירידין 2 מיט m-CPBA האט רעזולטירט אין דעם קאָרעספּאָנדירנדיקן N-אָקסייד 3 אין קוואַנטיטאַטיווער פּראָדוקציע. נאָך דער 2-אַמינאָאַזידאַציע פון ​​2, איז די ציקלאָקאָנדענסאַציע רעאַקציע באַשריבן דורך אַבראַמאָוויטש דורכגעפירט געוואָרן אין בענזין ביי 90°C כדי צו באַקומען דעם געוואונטשענעם 1-הידראָקסי-1H-פּיראָל-2-קאַרבאָניטריל 5 אין גראַמען. גיכקייט 60% (צוויי סטאַגעס). 15,16. מעטילאַציע און הידראָליז פון 4 האט דעמאָלט געגעבן 1-מעטאָקסי-1H-פּיראָל-2-קאַרבאָקסיל זויער (גערופן "קומאָטאָנישע זויער", 6) אין גוטער פּראָדוקציע (70%, צוויי סטאַגעס). צום סוף, אַמידאַציע דורך זויער כלאָריד אינטערמידייט 6 מיט וואַסעריקער אַמאָניאַק האט געגעבן קומאַמאָטאָ אַמיד 1 אין 98% פּראָדוקציע. אַלע ספּעקטראַלע דאַטן פון סינטעזירטן 1 זענען געווען ענלעך צו אפגעזונדערטן 1, אַזוי די סטרוקטור פון 1 איז באַשטימט געוואָרן;
אַלגעמיינע סינטעז און אַנאַליז פון דער ביאָלאָגישער אַקטיוויטעט פון אורבענאַמיד און אורבעניק זויער. (א) גאַנץ סינטעז פון קומאַמאָטאָ אַמיד. (ב) זיבן-טאָגיקע ווילד-טיפּ אַראַבידאָפּסיס קאָלאָמביאַ (קאָל) זוימען זענען געוואַקסן אויף מוראַשיגע און סקאָאָג (MS) פּלאַטעס מיט קומאַמאָנאַמיד 6 אָדער קומאַמאָנאַמיד 1 אין די אנגעגעבענע קאָנצענטראַציעס. וואָג באַר = 1 סענטימעטער.
ערשטנס, האבן מיר אפגעשאצט די ביאלאגישע אקטיוויטעטן פון אורבענאמיד און זיינע אינטערמידיעטן פאר זייער מעגלעכקייט צו מאדולירן פלאנץ וואוקס. מיר האבן צוגעגעבן פארשידענע קאנצענטראציעס פון אורסמאנאמיד 1 אדער אורסמאניש זויער 6 צו MS אגאר מעדיום און קולטיווירט אראבידאפסיס טאליאנא זוימען אויף דעם מעדיום. די פראבעס האבן געוויזן אז הויכע קאנצענטראציעס (500 μM) פון 6 האבן געשטערט ווארצל וואוקס (פיגור 2ב). דערנאך, האבן מיר גענערירט פארשידענע דעריוואטיוון דורך סובסטיטוטינג די N1 פאזיציע פון ​​6 און דורכגעפירט סטרוקטור-אקטיוויטעט באציאונג שטודיעס אויף זיי (דער אנאלאג סינטעז פראצעס איז באשריבן אין די שטיצנדיקע אינפארמאציע (SI)). אראבידאפסיס זוימען זענען געוואקסן אויף א מעדיום וואס אנטהאלט 50 μM אורסאנישע זויער דעריוואטיוון, און ווארצל לענג איז געמאסטן געווארן, ווי געוויזן אויפן בילד. ווי געוויזן אין פיגורן 3א, ב, און S1, האבן קומאמא זויערן פארשידענע לענג פון לינעארע אלקאקסי קייטן (9, 10, 11, 12, און 13) אדער גרויסע אלקאקסי קייטן (15, 16, און 17) ביי דער N1 פאזיציע. די דעריוואטיוון האבן געוויזן באדייטנדיקע אינהיביציע פון ​​ווארצל וואוקס. דערצו, האבן מיר געפונען אז די אנווענדונג פון 200 μM 10, 11, אדער 17 האט געשטערט די דזשערמאַניישאַן (פיגורן 3c און S2).
שטודיע פון ​​די סטרוקטור-טעטיקייט באַציִונג פון קומאַמאָטאָ אַמיד און פֿאַרבונדענע קאַמפּאַונדז. (אַ) סטרוקטור און סינטעז סכעמע פון ​​אַנאַלאָגן. (ב) קוואַנטיפֿיקאַציע פון ​​וואָרצל לענג פון 7-טאָג-אַלטע זוימען געוואַקסן אויף MS מעדיום מיט אָדער אָן 50 μM קומאַמאָנאַמיד דעריוואַטיוון. שטערן ווייַזן באַטייַטיק אונטערשיידן מיט שאַם באַהאַנדלונג (t טעסט, p< 0.05). n>18. דאטן ווערן געוויזן אלס דורכשניט ± SD. nt מיינט "נישט געטעסט" ווייל מער ווי 50% פון די זוימען האבן נישט געקערמט. (c) קוואנטיפיקאציע פון ​​קערמונג ראטע פון ​​באהאנדלטע זוימען אינקובירט פאר 7 טעג אין MS מעדיום מיט אדער אן 200 μM קומאמאנאמיד און פארבונדענע פארבינדונגען. שטערנס ווייזן באדייטנדע אונטערשיידן מיט שעם באהאנדלונג (טשי-קוואדראט טעסט). n=96.
אינטערעסאנט, די צוגאב פון אַלקיל זייט קייטן לענגער ווי C9 האט פארקלענערט די אינהיביטאָרישע טעטיקייט, וואָס סאַגדזשעסט אַז קומאַמאָטאָיק זויער-פֿאַרבונדענע קאַמפּאַונדז דאַרפן זייט קייטן פון אַ געוויסער גרייס צו ווייַזן זייער ביאָלאָגישע טעטיקייט.
ווייל סטרוקטור-טעטיקייט באציאונג אנאליז האט געוויזן אז C9 איז געווארן מאדיפיצירט צו אורסאנישע זויער און די נאנילאקסי דעריוואט פון אורסאנישע זויער (ווייטער באצייכנט אלס KAND 11) איז געווען דער מערסט עפעקטיווער פלאנץ וואוקס אינהיביטאר, האבן מיר דורכגעפירט א מער דעטאלירטע כאראקטעריזאציע פון ​​KAND 11. באהאנדלונג פון אראבידאפסיס מיט 50 μM KAND 11 האט כמעט אינגאנצן פארמיטן דזשערמאַניישאַן, משא"כ נידעריקערע קאנצענטראציעס (40, 30, 20, אדער 10 μM) פון KAND 11 האבן אינהיביטירט ווארצל וואוקס אין א דאז-אפהענגיקן אופן (פיגור 4a, b). צו טעסטן צי KAND 11 באאיינפלוסט ווארצל מעריסטעם לעבנס-פעאיקייט, האבן מיר אויסגעפארשט ווארצל מעריסטעמס געפארבט מיט פראפידיום יאדיד (PI) און געמאסטן די מעריסטעם שטח גרייס. די גרייס פון דעם מעריסטעם פון זוימען וואָס זענען געוואַקסן אויף אַ מעדיום מיט 25 μM KAND-11 איז געווען 151.1 ± 32.5 μm, בשעת די גרייס פון דעם מעריסטעם פון זוימען וואָס זענען געוואַקסן אויף אַ קאָנטראָל מעדיום מיט DMSO איז געווען 264.7 ± 30.8 μm (פיגור 4c, d), וואָס ווײַזט אַז KAND-11 שטעלט צוריק צעלולאַרע טעטיקייט. פאַרשפּרייטונג. וואָרצל מעריסטעם. אין איינקלאַנג מיט דעם, האָט KAND 11 באַהאַנדלונג רעדוצירט די סומע פון ​​צעל טיילונג מאַרקער CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS סיגנאַל אין דעם וואָרצל מעריסטעם (פיגור 4e) 17. די רעזולטאַטן ווײַזן אַז KAND 11 אינהיביטירט וואָרצל וווּקס דורך רעדוצירן צעל פּראָליפעריישאַן טעטיקייט.
אנאליז פון דעם אינהיביטארישן עפעקט פון אורבענאניש זויער דעריוואטן (ורבענילאקסי דעריוואטן) אויף וואוקס. (א) 7-טאג-אלטע ווילד-טיפ קאל זוימען וואס זענען געוואקסן אויף MS פלאטעס מיט די אנגעגעבענע קאנצענטראציעס פון KAND 11. וואג באר = 1 סענטימעטער. (ב) קוואנטיפיקאציע פון ​​ווארצל לענג. אותיות ווייזן באדייטנדע אונטערשיידן (Tukey HSD טעסט, p< 0.05). n>16. דאטן ווערן געוויזן אלס דורכשניט ± SD. (c) קאנפאקאלע מיקראסקאפיע פון ​​פראפידיום יאדיד-געפארבטע ווילד-טיפ Col ווארצלען וואס זענען געוואקסן אויף MS פלאטעס מיט אדער אן 25 μM KAND 11. ווייסע קלאַמערן ווייזן ווארצל מעריסטעם. סקאלע באר = 100 μm. (d) קוואנטיפיקאציע פון ​​ווארצל מעריסטעם גרייס (n = 10 ביז 11). סטאטיסטישע אונטערשיידן זענען באשטימט געווארן ניצנדיג t-טעסט (p< 0.05). די שטריקן רעפּרעזענטירן די דורכשניטלעכע מעריסטעם גרייס. (e) דיפערענציעלע אינטערפערענץ קאנטראסט (DIC) מיקראָסקאָפּיע פון ​​אַ וואָרצל מעריסטעם וואָס כּולל די CDKB2 קאָנסטרוקט; 1pro: CDKB2; 1-GUS געפֿאַרבט און געפֿאַרבט אויף 5-טאָג-אַלטע זוימען וואָס זענען געוואַקסן אויף MS פּלאַטעס מיט אָדער אָן 25 µM KAND אַסיי.
די פיטאטאקסיסיטי פון KAND 11 איז ווייטער געטעסט געווארן מיט אן אנדער דיקאטילעדאנעז פלאנץ, טאבאק (Nicotiana tabacum), און א הויפט לאנד פלאנץ מאדעל ארגאניזם, לעבערווארץ (Marchantia polymorpha). ווי אין דעם פאל פון אראבידאפסיס, טאבאק SR-1 זוימען וואס זענען געוואקסן אויף א מעדיום וואס האט אנטהאלטן 25 μM KAND 11 האבן געשאפן קירצערע ווארצלען (פיגור 5a). דערצו, 40 פון 48 זוימען האבן געקייַמט אויף פּלאַטעס וואס האבן אנטהאלטן 200 μM KAND 11, משא"כ אלע 48 זוימען האבן געקייַמט אויף מאָק-באהאנדלטע מעדיע, וואס ווייזט אז העכערע קאנצענטראציעס פון KAND זענען געווען באדייטנד (p< 0.05; כי טעסט -קוואַדראַט) האט געשטערט די דזשערמאַניישאַן פון טאַבאַק. (פיגור 5ב). דערצו, די קאָנצענטראַציע פון ​​KAND 11 וואָס האָט געשטערט באַקטיריעלן וואוקס אין לעבערוואָרץ איז געווען ענלעך צו דער עפעקטיווער קאָנצענטראַציע אין אַראַבידאָפּסיס (פיגור 5ג). די רעזולטאַטן ווייַזן אַז KAND 11 קען שטערן דעם וואוקס פון אַ פאַרשיידנקייט פון געוויקסן. מיר האָבן דערנאָך אויסגעפאָרשט די מעגלעכע ציטאָטאָקסיסיטי פון בער מאָנאָאַמיד-פֿאַרבונדענע קאַמפּאַונדז אין אַנדערע אָרגאַניזמען, נעמלעך מענטשלעכע HeLa צעלן און Escherichia coli שטאַם DH5α, ווי פארשטייערס פון העכערע כייַע און באַקטיריעל צעלן, ריספּעקטיוולי. אין אַ סעריע פון ​​צעל פּראָליפעריישאַן אַסייז, האָבן מיר באמערקט אַז קומאַמאָנאַמיד 1, קומאַמאָנאַמידיק זויער 6, און KAND 11 האָבן נישט אַפעקטירט דעם וואוקס פון HeLa אָדער E. coli צעלן ביי קאָנצענטראַציעס פון 100 μM (פיגור 5ד,ע).
וואוקס אינהיביציע פון ​​KAND 11 אין נישט-אראבידאפסיס ארגאניזמען. (א) צוויי-וואכן-אלטע ווילד-טיפ SR-1 טאבאק זוימען זענען געוואקסן אויף ווערטיקאל פאזיציאנירטע MS פלאטעס מיט 25 μM KAND 11. (ב) צוויי-וואכן-אלטע ווילד-טיפ SR-1 טאבאק זוימען זענען געוואקסן אויף האריזאנטאל פאזיציאנירטע MS פלאטעס מיט 200 μM KAND 11. (ג) צוויי-וואכן-אלטע ווילד-טיפ טאק-1 לעבערווארץ קנאפּן געוואקסן אויף גאמבאָרג B5 פלאטעס מיט די אנגעגעבענע קאנצענטראציעס פון KAND 11. רויטע פײַלן ווײַזן אויף ספּאָרן וואָס האָבן אויפגעהערט וואַקסן אין די צוויי-וואכן אינקובאַציע פּעריאָד. (ד) צעל פּראָליפעראַציע אַסיי פון HeLa צעלן. די נומער פון לעבעדיקע צעלן איז געמאסטן אין פעסטע צייט אינטערוואַלן ניצן אַ צעל ציילן קיט 8 (דאָדזשינדאָ). ווי אַ קאָנטראָל, HeLa צעלן זענען באהאנדלט מיט 5 μg/ml אַקטינאָמיסין D (אַקט D), וואָס אינהיביט RNA פּאָלימעראַזע טראַנסקריפּציע און ז צעל טויט. אַנאַליזעס זענען דורכגעפירט אין טריפּליקאַט. (ה) E. coli צעל פּראָליפעראַציע אַסיי. E. coli וואוקס איז אַנאַלייזד דורך מעסטן OD600. אלס א קאנטראל, זענען צעלן באהאנדלט געווארן מיט 50 μg/ml אמפיציללין (Amp), וואס אינהיביטירט באַקטיריעלע צעל וואנט סינטעז. אנאליזן זענען דורכגעפירט געווארן אין דרייפאכיג.
כדי צו דעשיפרירן דעם מעכאניזם פון אקציע פון ​​ציטאטאקסיסיטי געפֿארזאַכט דורך אוראַמיד-פֿאַרבונדענע קאַמפּאַונדז, האָבן מיר ווידער אַנאַליזירט אורבעניק זויער דעריוואַטיוון מיט מיטלמעסיקע אינהיביטאָרישע ווירקונגען, ווי געוויזן אויף דער בילד. ווי געוויזן אין פֿיגורן 2ב, 6א, האָבן זוימען וואָס זענען געוואַקסן אויף אַגאַר פּלאַטעס מיט הויכע קאָנצענטראַציעס (200 μM) פון אורמאָטאָניק זויער 6 פּראָדוצירט קירצערע און לינקס-געבויגענע וואָרצלען (θ = – 23.7 ± 6.1), בשעת פֿון זוימען וואָס זענען געוואַקסן אויף דער קאָנטראָל מעדיום, האָבן די זוימען פּראָדוצירט כּמעט גלייכע וואָרצלען (θ = – 3.8 ± 7.1). דעם כאַראַקטעריסטישן אָבליקן וואוקס איז באַקאַנט צו רעזולטירן פֿון דיספֿונקציע פֿון קאָרטיקאַלע מיקראָטובולעס14,18. אין איינקלאַנג מיט דעם געפֿינס, האָבן די מיקראָטובול-דעסטאַביליזירנדיקע מעדיקאַמענטן דיסאָפּיראַמיד און אָריזאַלין געפֿירט צו ענלעכע וואָרצל-נייטונג אונטער אונדזערע וואוקס-באַדינגונגען (פֿיגורן 2ב, 6א). אין דער זעלבער צייט, האָבן מיר געטעסט אורמאָטאָניק זויער דעריוואַטיוון און אויסגעקליבן עטלעכע פֿון זיי וואָס, ביי געוויסע קאָנצענטראַציעס, האָבן געפֿירט צו אָבליקן וואָרצל-וואוקס. קאַמפּאַונדז 8, 9, און 15 האָבן געביטן די ריכטונג פון וואָרצל וווּקס ביי 75 μM, 50 μM, און 40 μM, ריספּעקטיוולי, וואָס ווייַזט אַז די קאַמפּאַונדז קענען עפעקטיוו דעסטאַביליזירן מיקראָטובולעס (פיגור 2b, 6a). מיר האָבן אויך טעסטעד די מערסט שטאַרק אורסאָליק זויער דעריוואַט, KAND 11, ביי אַ נידעריקער קאַנסאַנטריישאַן (15 μM) און געפֿונען אַז אַפּליקאַציע פון ​​KAND 11 ינכיבאַטעד וואָרצל וווּקס און אַז די ריכטונג פון וואָרצל וווּקס איז געווען אומגלייַך, כאָטש זיי טענד צו נייטן צו די לינקס (פיגור C3). . ווייַל העכער קאַנסאַנטריישאַנז פון מיקראָטובול-דעסטאַביליזינג דרוגס מאל ינכיבאַט פלאַנצן וווּקס אלא ווי פאַרשאַפן וואָרצל טילטינג, מיר דערנאָך אַססעססעד די מעגלעכקייט אַז KAND 11 אַפעקץ מיקראָטובולעס דורך אָבסערווירן קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס אין וואָרצל עפּידערמאַל סעלז. ימיונאָכיסטאָכעמיע ניצן אַנטי-β-טובולין אַנטיבאָדיעס אין עפּידערמאַל סעלז פון סידלינג וואָרצל באהאנדלט מיט 25 μM KAND 11 האט געוויזן די פאַרשווינדן פון כּמעט אַלע קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס אין עפּידערמאַל סעלז אין די ילאָנגגיישאַן זאָנע (פיגור 6b). די רעזולטאַטן ווײַזן אָן אַז קומאַמאָטאָניק זויער און זייַנע דעריוואַטיוון ווירקן דירעקט אָדער אומדירעקט אויף מיקראָטובולעס צו צעשטערן זיי און אַז די קאַמפּאַונדז זענען נײַע מיקראָטובולע ​​אינהיביטאָרן.
אורסאנישע זויער און זיינע דעריוואטיוון ענדערן קארטיקאלע מיקראטובולעס אין אראבידאפסיס טאליאנא. (א) ווארצל-נייגונג ווינקל געמאסטן אין דער אנוועזנהייט פון פארשידענע אורמאטאנישע זויער דעריוואטיוון ביי די אנגעגעבענע קאנצענטראציעס. די ווירקונגען פון צוויי פארבינדונגען באקאנט צו אינהיבירן מיקראטובולעס: דיסאפיראמיד און אריזאלין זענען אויך אנאליזירט געווארן. די אינסעט ווייזט דעם סטאנדארט גענוצט צו מעסטן ווארצל וואוקס ווינקל. שטערנס ווייזן באדייטנדע אונטערשיידן מיט שעם באהאנדלונג (t טעסט, p< 0.05). n>19. סקאַלע באַר = 1 ס״מ. (ב) קאָרטיקאַלע מיקראָטובולעס אין עפּידערמאַל צעלן אין דער פֿאַרלענגערונג זאָנע. מיקראָטובולעס אין ווילד-טיפּ אַראַבידאָפּסיס קאָל וואָרצלען וואָס זענען געוואַקסן אויף MS פּלאַטעס מיט אָדער אָן 25 μM KAND 11 זענען וויזואַליזירט געוואָרן דורך אימונאָכיסטאָכעמישע פֿאַרבונג מיט β-טובולין ערשטיקע אַנטיבאָדיעס און אַלעקסאַ פֿלואָר-קאָנדזשוגירטע צווייטיקע אַנטיבאָדיעס. סקאַלע באַר = 10 μm. (ג) מיטאָטישע סטרוקטור פֿון מיקראָטובולעס אין דעם וואָרצל מעריסטעם. מיקראָטובולעס זענען וויזואַליזירט געוואָרן מיט אימונאָכיסטאָכעמישע פֿאַרבונג. מיטאָטישע סטרוקטורן, אַרייַנגערעכנט פּראָפֿאַזע זאָנעס, שפּינדלען און פֿראַגמאָפּלאַסטן, זענען געציילט געוואָרן פֿון קאָנפֿאָקאַלע בילדער. פײַלן ווײַזן אויף מיטאָטישע מיקראָטובול סטרוקטורן. אַסטעריסקס ווײַזן אויף באַדײַטנדיקע אונטערשיידן מיט שאַם באַהאַנדלונג (t טעסט, p< 0.05). n>9. סקאַלע באַר = 50 מיקראָמעטער.
כאָטש אורסאַ האט די מעגלעכקייט צו שטערן מיקראָטובול פונקציע, ווערט ערוואַרטעט אַז זיין מעכאַניזם פון קאַמף וועט זיין אַנדערש פון טיפּישע מיקראָטובול דעפּאָלימעריזירנדיקע אגענטן. למשל, העכערע קאָנצענטראַציעס פון מיקראָטובול דעפּאָלימעריזירנדיקע אגענטן ווי דיסאָפּיראַמיד און אָריזאַלין פאַראורזאַכן אַניזאָטראָפּישע יקספּאַנשאַן פון עפּידערמאַלע צעלן, בשעת KAND 11 טוט נישט. אין דערצו, קאָ-אַפּליקאַציע פון ​​KAND 11 און דיסאָפּיראַמיד האט רעזולטירט אין אַ קאַמביינד דיסאָפּיראַמיד-ינדוסט וואָרצל וווּקס ענטפער און KAND 11-ינדוסט וווּקס אינהיביציע איז באמערקט געוואָרן (פיגור S4). מיר האָבן אויך אַנאַליזירט די ענטפער פון די היפּערסענסיטיוו דיסאָפּיראַמיד 1-1 (phs1-1) מוטאַנט צו KAND 11. phs1-1 האט אַ ניט-קאַנאָניש טובולין קינאַזע פונט מוטאַציע און פּראָדוצירט קירצערע וואָרצלען ווען באהאנדלט מיט דיסאָפּיראַמיד9,20. phs1-1 מוטאַנט זוימען וואָס זענען געוואַקסן אויף אַגאַר מעדיום מיט KAND 11 האָבן געהאַט קירצערע וואָרצלען ענלעך צו די וואָס זענען געוואַקסן אויף דיסאָפּיראַמיד (פיגור S5).
דערצו, האבן מיר באמערקט מיטאטישע מיקראָטובול סטרוקטורן, ווי פּראָפֿאַזע זאָנעס, שפּינדלען, און פֿראַגמאָפּלאַסטן, אין די וואָרצל מעריסטעם פֿון זוימען באַהאַנדלט מיט KAND 11. אין איינקלאַנג מיט די אָבסערוואַציעס פֿאַר CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, איז באמערקט געוואָרן אַ באַדייטנדיקע פֿאַרקלענערונג אין דער צאָל מיטאָטישע מיקראָטובולעס (פֿיג. .6c).
כדי צו כאַראַקטעריזירן די ציטאָטאָקסיסיטי פון KAND 11 ביי סובסעלולאַרע רעזאָלוציע, האָבן מיר באַהאַנדלט טאַבאַק BY-2 סאַספּענשאַן צעלן מיט KAND 11 און באַאָבאַכט זייער רעאַקציע. מיר האָבן ערשט צוגעגעבן KAND 11 צו BY-2 צעלן וואָס אויסדריקן TagRFP-TUA6, וואָס פלורעסענטלי לייבאַלד מיקראָטובולעס, צו אַססעססירן די ווירקונג פון KAND 11 אויף קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס. קאָרטיקאַל מיקראָטובולע ​​געדיכטקייט איז אַססעססעד מיט בילד אַנאַליסיס, וואָס קוואַנטיפיצירט די פּראָצענט פון ציטאָסקעלעטאַל פּיקסעלס צווישן ציטאָפּלאַזמיש פּיקסעלס. די אַסיי רעזולטאַטן האָבן געוויזן אַז נאָך באַהאַנדלונג מיט 50 μM אָדער 100 μM KAND 11 פֿאַר 1 שעה, די געדיכטקייט איז באַטייטיק דיקריסט צו 0.94 ± 0.74% אָדער 0.23 ± 0.28%, ריספּעקטיוולי, בשעת די געדיכטקייט פון צעלן באַהאַנדלט מיט DMSO, איז געווען 1.61 ± 0.34% (פיגור 7a). די רעזולטאַטן זענען קאָנסיסטענט מיט די אָבסערוואַציע אין אַראַבידאָפּסיס אַז KAND 11 באַהאַנדלונג ינדוסירט דעפּאָלימעריזאַציע פון ​​קאָרטיקאַל מיקראָטובולעס (פיגור 6b). מיר האָבן אויך אויסגעפאָרשט די BY-2 ליניע מיט GFP-ABD-געמאַרקטע אַקטין פילאַמענטן נאָך באַהאַנדלונג מיט דער זעלבער קאָנצענטראַציע פון ​​KAND 11 און באמערקט אַז KAND 11 באַהאַנדלונג האָט צעשטערט די אַקטין פילאַמענטן. באַהאַנדלונג מיט 50 μM אָדער 100 μM KAND 11 פֿאַר 1 שעה האָט באַדייטנד רעדוצירט די אַקטין פילאַמענט געדיכטקייט צו 1.20 ± 0.62% אָדער 0.61 ± 0.26%, ריספּעקטיוולי, בשעת די געדיכטקייט אין DMSO-באַהאַנדלטע צעלן איז געווען 1.69 ± 0.51% (פיגור 2). 7ב). די רעזולטאַטן קאָנטראַסטירן מיט די ווירקונגען פון פּראָפּיזאַמיד, וואָס אַפעקטירט נישט אַקטין פילאַמענטן, און לאַטרונקולין ב, אַן אַקטין דעפּאָלימעריזאַטאָר וואָס אַפעקטירט נישט מיקראָטובולעס (SI פיגור S6). אין דערצו, באַהאַנדלונג מיט קומאַמאָנאַמיד 1, קומאַמאָנאַמיד זויער 6, אָדער KAND 11 האָט נישט אַפעקטירט מיקראָטובולעס אין HeLa צעלן (SI פיגור S7). אזוי, ווערט געהאלטן אז דער מעכאניזם פון אקציע פון ​​KAND 11 איז אנדערש ווי יענע פון ​​באקאנטע ציטאסקעלעטאן דיסראפטארס. דערצו, אונזער מיקראסקאפישע אבזערוואציע פון ​​BY-2 צעלן באהאנדלט מיט KAND 11 האט געוויזן דעם אנהייב פון צעל טויט בעת KAND 11 באהאנדלונג און געוויזן אז דער פראפארציע פון ​​Evans בלוי-געפארבטע טויטע צעלן האט זיך נישט באדייטנד פארגרעסערט נאך 30 מינוט פון KAND 11 באהאנדלונג, משא"כ נאך 90 מינוט פון באהאנדלונג מיט 50 μM אדער 100 μM KAND, איז די צאל טויטע צעלן פארגרעסערט געווארן צו 43.7% אדער 80.1%, בהתאמה (פיגור 7c). צוזאמען גענומען, ווייזן די דאטן אז דער נייער אורסאליק זויער דעריוואט KAND 11 איז א פלאנץ-ספעציפישער ציטאסקעלעטאלער אינהיביטאר מיט א פריער אומבאקאנטן מעכאניזם פון אקציע.
KAND באַאיינפלוסט קאָרטיקאַלע מיקראָטובולעס, אַקטין פילאַמענטן, און לעבנס-פעאיקייט פון טאַבאַק BY-2 צעלן. (א) וויזואַליזאַציע פון ​​קאָרטיקאַלע מיקראָטובולעס אין BY-2 צעלן אין דער אנוועזנהייט פון TagRFP-TUA6. BY-2 צעלן באַהאַנדלט מיט KAND 11 (50 μM אָדער 100 μM) אָדער DMSO זענען געפּrüפט געוואָרן דורך קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּי. קאָרטיקאַלע מיקראָטובולע ​​געדיכטקייט איז קאַלקולירט געוואָרן פון מיקראָגראַפס פון 25 אומאָפּהענגיקע צעלן. אותיות ווייַזן באַדייטנדיקע אונטערשיידן (Tukey HSD טעסט, p< 0.05). סקאַלע באַר = 10 µm. (ב) קאָרטיקאַלע אַקטין פילאַמענטן אין BY-2 צעלן וויזואַליזירט אין דער אנוועזנהייט פון GFP-ABD2. BY-2 צעלן באַהאַנדלט מיט KAND 11 (50 µM אדער 100 µM) אדער DMSO זענען געפּrüפט געוואָרן דורך קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּי. די געדיכטקייט פון קאָרטיקאַלע אַקטין פילאַמענטן איז קאַלקולירט געוואָרן פון מיקראָגראַפס פון 25 אומאָפּהענגיקע צעלן. אותיות ווייַזן באַדייטנדיקע אונטערשיידן (Tukey HSD טעסט, p< 0.05). סקאַלע באַר = 10 מיקראָמעטער. (c) אָבסערוואַציע פון ​​טויטע BY-2 צעלן דורך עוואַנס בלוי פֿאַרבונג. BY-2 צעלן באַהאַנדלט מיט KAND 11 (50 מיקראָמעטער אָדער 100 מיקראָמעטער) אָדער DMSO זענען געפּrüפֿט געוואָרן דורך העל-פעלד מיקראָסקאָפּיע. n=3. סקאַלע באַר = 100 מיקראָמעטער.
די אנטדעקונג און אנווענדונג פון נייע נאטירלעכע פראדוקטן האט געפירט צו באדייטנדע פארשריטן אין פארשידענע אספעקטן פון מענטשלעכן לעבן, אריינגערעכנט מעדיצין און לאנדווירטשאפט. היסטארישע פארשונג איז דורכגעפירט געווארן צו באקומען נוצלעכע פארבינדונגען פון נאטירלעכע רעסורסן. אין באזונדער, אקטינאמיסעטן זענען באקאנט צו זיין נוצליך ווי אנטי-פאראזיטישע אנטיביאטיקס פאר נעמאטאדן צוליב זייער מעגלעכקייט צו פראדוצירן פארשידענע צווייטיקע מעטאבאליטן ווי אַווערמעקטין, די הויפט פארבינדונג פון יווערמעקטין און בלעאמיצין און זיינע דעריוואטיוון, גענוצט מעדיציניש ווי אן אנטי-קענסער אגענט21,22. אזוי אויך, א פארשיידנקייט פון הערביסידאלע פארבינדונגען זענען אנטדעקט געווארן פון אקטינאמיסעטן, עטלעכע פון ​​וועלכע ווערן שוין גענוצט קאמערציעל1,23. דעריבער, די אנאליז פון אקטינאמיסעט מעטאבאליטן צו אפגעזונדערן נאטירלעכע פראדוקטן מיט געוואונטשענע ביאלאגישע אקטיוויטעטן ווערט באטראכט אלס אן עפעקטיווע סטראטעגיע. אין דעם שטודיע, האבן מיר אנטדעקט א נייע פארבינדונג, קאומאמאנאמיד, פון ס. וועררעענסיס און עס ערפאלגרייך סינטעזירט. אורסאנישע זויער איז א סינטעטישער אינטערמידיעט פון אורבענאמיד און זיינע דעריוואטיוון. עס קען פאראורזאכן כאראקטעריסטישע ווארצל קרולינג, אויסשטעלן מיטלמעסיגע ביז שטארקע הערביסידאלע אקטיוויטעט, און דירעקט אדער אינדירעקט שאדן פלאנץ מיקראטובולעס. אבער, דער מעכאניזם פון ווירקונג פון אורמאטאנישע זויער קען זיין אנדערש פון יענעם פון עקזיסטירנדע מיקראָטובול אינהיביטאָרן, ווייל KAND 11 צעשטערט אויך אקטין פילאַמענטן און פאַראורזאַכט צעל טויט, וואָס סאַגדזשעסטירט אַ רעגולאַטאָרישן מעכאניזם דורך וועלכן אורמאטאנישע זויער און זיינע דעריוואַטיוון השפּעה האָבן אויף אַ ברייטע קייט פון ציטאָסקעלעטאַלע סטרוקטורן.
ווייטערדיגע דעטאלירטע כאראקטעריזאציע פון ​​אורבאנאניש זויער וועט העלפן בעסער פארשטיין דעם מעכאניזם פון אקציע פון ​​אורבאנאניש זויער. ספעציעל, די נעקסטע ציל איז צו אפשאצן די מעגלעכקייט פון אורסאניש זויער צו בינדן צו רעדוצירטע מיקראטובולעס צו באשטימען צי אורסאניש זויער און זיינע דעריוואטיוון ווירקן גלייך אויף מיקראטובולעס און דעפאלימעריזירן זיי, אדער צי זייער אקציע רעזולטירט אין מיקראטובול דעסטאביליזאציע. דערצו, אין דעם פאל וואו מיקראטובולעס זענען נישט קיין דירעקטע ציל, וועט אידענטיפיצירן דעם אקציע-ארט און מאלעקולארע צילן פון אורסאניש זויער אויף פלאנץ צעלן העלפן ווייטער פארשטיין די אייגנשאפטן פון פארבינדענע פארבינדונגען און מעגליכע וועגן צו פארבעסערן הערביסידאלע טעטיקייט. אונזער ביאאקטיוויטעט אסיי האט געוויזן די אייגנארטיגע ציטאטאקסישע מעגלעכקייט פון אורסאניש זויער אויף דעם וואוקס פון פלאנצן ווי אראבידאפסיס טאליאנא, טאבאק און לעבערווארט, בשעת נישט E. coli און נישט HeLa צעלן זענען געווען באאיינפלוסט. קליינע אדער קיין טאקסיקיטעט צו כייַע צעלן איז א מעלה פון אורסאניש זויער דעריוואטיוון אויב זיי ווערן אנטוויקלט אלס הערביסיידן פאר באנוץ אין אפענע לאנדווירטשאפטלעכע פעלדער. טאקע, ווייל מיקראטובולעס זענען געווענליכע סטרוקטורן אין עוקאריאטן, איז זייער סעלעקטיווע אינהיביציע אין פלאנצן א שליסל-פאדערונג פאר הערביסיידן. למשל, פּראָפּיזאַמיד, אַ מיקראָטובול דעפּאָלימעריזירנדיקער אַגענט וואָס בינדט זיך גלייך צו טובולין און אינהיביטירט פּאָלימעריזאַציע, ווערט גענוצט ווי אַ הערביציד צוליב זיין נידעריקע טאַקסיסיטי צו כייַע צעלן24. אין קאַנטראַסט צו דיסאָפּיראַמיד, האָבן פֿאַרבונדענע בענזאַמידן אַנדערע ציל ספּעציפֿישקייטן. אין דערצו צו פלאַנצן מיקראָטובולעס, אינהיביטירט RH-4032 אָדער בענזאָקסאַמיד אויך מיקראָטובולעס פון כייַע צעלן אָדער אָאָמיסעטעס, ריספּעקטיוולי, און זאַלילאַמיד ווערט גענוצט ווי אַ פונגיציד צוליב זיין נידעריקע פיטאָטאָקסיסיטי25,26,27. דער ניי אַנטדעקטער בער און זיינע דעריוואַטיוון ווייַזן סעלעקטיווע ציטאָטאָקסיסיטי קעגן פלאַנצן, אָבער עס איז ווערט צו באַמערקן אַז ווייטערדיקע מאָדיפֿיקאַציעס קענען ענדערן זייער ציל ספּעציפֿישקייט, פּאָטענציעל צושטעלן נאָך דעריוואַטיוון פֿאַר די קאָנטראָל פון פּאַטאַדזשעניק פונגי אָדער אָאָמיסעטעס.
די אייגנארטיגע אייגנשאפטן פון אורבענאניש זויער און זיינע דעריוואטיוון זענען נוצלעך פאר זייער אנטוויקלונג אלס הערביצידן און נוצן אלס פארשונג מכשירים. די וויכטיקייט פון די ציטאסקעלעטאן אין קאנטראלירן פלאנץ צעל פאָרעם איז ברייט אנערקענט. פריערדיגע שטודיעס האבן געוויזן אז פלאנצן האבן אנטוויקלט קאמפליצירטע מעכאניזמען פון קארטיקאלע מיקראָטובול ארגאניזאציע דורך קאנטראלירן מיקראָטובול דינאמיק צו ריכטיג קאנטראלירן מארפאגענעזיס. א גרויסע צאל מאלעקולן פאראנטווארטלעך פאר דער רעגולאציע פון ​​מיקראָטובול טעטיקייט זענען געווארן אידענטיפיצירט, און פארבונדענע פארשונג איז נאך אנגייענד3,4,28. אונזער היינטיגע פארשטענדעניש פון מיקראָטובול דינאמיק אין פלאנץ צעלן דערקלערט נישט פולשטענדיג די מעכאניזמען פון קארטיקאלע מיקראָטובול ארגאניזאציע. למשל, כאטש ביידע דיסאפיראמיד און אריזאלין קענען דעפאלימעריזירן מיקראָטובולעס, דיסאפיראמיד פאראורזאכט שווערע ווארצל פארדרייאונג בשעת אריזאלין האט א רעלאטיוו מילדן עפעקט. דערצו, מוטאציעס אין טובולין, וואס סטאביליזירט מיקראָטובולעס, פאראורזאכן אויך דעקסטראראטאציע אין ווארצלען, בשעת פאקליטאקסעל, וואס סטאביליזירט אויך מיקראָטובול דינאמיק, טוט נישט. דעריבער, שטודירן און אידענטיפיצירן די מאלעקולארע צילן פון אורסאליק זויער זאל צושטעלן נייע איינזיכטן אין דער רעגולאציע פון ​​פלאנץ קאָרטיקאלע מיקראָטובולעס. אזוי אויך, צוקונפטיגע פארגלייכן פון כעמיקאלן וואס זענען עפעקטיוו אין פארשפרייטן פארדרייטע וואוקס, ווי למשל דיסאפיראמיד, און ווייניגער עפעקטיווע כעמיקאלן, ווי למשל אריזאלין אדער קומאמאטארישע זויער, וועלן געבן אנווייזונגען צו ווי אזוי פארדרייטע וואוקס פאסירט.
אויף דער אנדערער האַנט, פארטיידיקונג-פֿאַרבונדענע ציטאָסקעלעטאַלע רעאָרגאַניזאַציעס זענען נאָך אַ מעגלעכקייט צו דערקלערן די ציטאָטאָקסיסיטי פון אורסאָניק זויער. אינפעקציע פון ​​אַ פּאַטאַדזשען אָדער אײַנפֿירן אַן עליטאָר אין פלאַנצן צעלן פאַראורזאַכט מאל צעשטערונג פון די ציטאָסקעלעטאָן און דערנאָך צעל טויט29. למשל, עס איז געמאָלדן געוואָרן אַז אָאָמיצעטע-דערייווד קריפּטאָקסאַנטין צעשטערט מיקראָטובולעס און אַקטין פילאַמענץ איידער טאַבאַק צעל טויט, ענלעך צו וואָס פּאַסירט מיט KAND באַהאַנדלונג30,31. די ענלעכקייטן צווישן פארטיידיקונג רעאַקציעס און צעלולאַרע רעאַקציעס וואָס ווערן געפֿירט דורך אורסאָניק זויער האָבן אונדז געפֿירט צו אַ כייפּאַטאַסאַז אַז זיי טריגערן געוויינטלעכע צעלולאַרע פּראָצעסן, כאָטש אַ שנעלער און שטאַרקער ווירקונג פון אורסאָניק זויער ווי קריפּטאָקסאַנטין איז קלאָר. אָבער, שטודיעס האָבן געוויזן אַז צעשטערונג פון אַקטין פילאַמענץ פּראָמאָטירט ספּאָנטאַנע צעל טויט, וואָס ווערט נישט שטענדיק באַגלייט דורך מיקראָטובולע ​​צעשטערונג29. אין דערצו, בלייבט צו זען צי אָדער דער פּאַטאַדזשען אָדער עליטאָר פאַראורזאַכט פאַרדרייט וואָרצל וווּקס, ווי אורסאָניק זויער דעריוואַטיוון טאָן. אַזוי, מאָלעקולאַר וויסן וואָס פֿאַרבינדט פארטיידיקונג רעאַקציעס און די ציטאָסקעלעטאָן איז אַן אַטראַקטיוו פּראָבלעם צו זיין אַדרעסירט. דורך אויסנוצן די אנוועזנהייט פון נידעריק-מאָלעקולאַרע וואָג קאַמפּאַונדז שייך צו אורסאָניק זויער, ווי אויך אַ קייט פון דעריוואַטיוון מיט פארשידענע פּאָטענציעס, קענען זיי צושטעלן געלעגנהייטן צו צילן אומבאַקאַנטע צעלולאַרע מעכאַניזמען.
צוזאַמען גענומען, די ענטדעקונג און אַפּליקאַציע פון ​​נייַע קאַמפּאַונדז וואָס מאָדולירן מיקראָטובול דינאַמיק וועט צושטעלן שטאַרקע מעטאָדן צו אַדרעסירן די קאָמפּלעקסע מאָלעקולאַרע מעханіזמען וואָס ליגן אונטער די פאָרעם פון פלאַנצן צעל באַשטימונג. אין דעם קאָנטעקסט, די לעצטנס דעוועלאָפּעד קאַמפּאַונד אורמאָטאָניק זויער, וואָס אַפעקטירט מיקראָטובולעס און אַקטין פילאַמענץ און ינדוצירט צעל טויט, קען צושטעלן אַ געלעגנהייט צו דעשיפרירן די פֿאַרבינדונג צווישן מיקראָטובול קאָנטראָל און די אנדערע מעханіזמען. אַזוי, כעמישע און ביאָלאָגישע אַנאַליז מיט אורבענאָניק זויער וועט העלפֿן אונדז פֿאַרשטיין די מאָלעקולאַרע רעגולאַטאָרישע מעханіזמען וואָס קאָנטראָלירן די פלאַנצן ציטאָסקעלעטאָן.
אריינשפּרינגען S. werraensis MK493-CF1 אין א 500 מל באַפֿלטע ערלענמייער פֿלעש וואָס ענטהאַלט 110 מל זוימען מעדיום באַשטייענדיק פֿון 2% (w/v) גאַלאַקטאָז, 2% (w/v) עסענץ פּאַסטע, 1% (w/v) באַקטאָ קאָמפּאָזיציע. -סויטאָן (טהערמאָ פֿישער סייענטיפיק, ינק.), 0.5% (w/v) קאָרן עקסטראַקט (KOGOSTCH קאָו., לטד., יאַפּאַן), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 און 0.2% CaCO3 אין דעיאָניזירט וואַסער. (pH 7.4 פֿאַר סטעריליזאַציע). די זוימען קולטורן זענען אינקובירט געוואָרן אויף אַ ראָטאַרי שעיקער (180 רפּם) ביי 27°C פֿאַר 2 טעג. פּראָדוקציע קולטיוואַציע דורך האַרטשטאַט פֿערמענטאַציע. די זוימען קולטור (7 מל) איז אריבערגעפירט געווארן אין א 500 מל K-1 פלעשל וואס האט אנטהאלטן 40 ג פראדוקציע מעדיום באשטייענדיק פון 15 ג געפרעסטע גערשטן (MUSO Co., Ltd., יאפאן) און 25 ג דעיאָניזירט וואסער (pH נישט צוגעפאסט פאר סטעריליזאציע). פערמענטאציע איז דורכגעפירט געווארן ביי 30°C אין דער פינצטערניש פאר 14 טעג. די פערמענטאציע מאטעריאל איז עקסטראקטירט געווארן מיט 40 מל/פלעשל EtOH און צענטריפוגירט (1500 ג, 4°C, 10 מינוט). די קולטור סופערנאטאנט (60 מל) איז עקסטראקטירט געווארן מיט א געמיש פון 10% MeOH/EtOAc. די אָרגאַנישע שיכט איז געוואָרן פֿאַרדאַמפּט אונטער רעדוצירטן דרוק צו באַקומען אַ רעשט (59.5 מג), וואָס איז געוואָרן אונטערגעוואָרפן צו HPLC מיט גראַדיענט עלוציע (0–10 מינוט: 90%) אויף אַ ריווערס פֿאַזע קאָלום (SHISEIDO CAPSELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × לענג 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 מינוט: 90% H2O/CH3CN צו 70% H2O/CH3CN (גראַדיענט), 35–45 מינוט: 90% H2O/EtOH, 45–155 מינוט: 90% H2O/EtOH צו 100% EtOH (גראַדיענט (גראַדיענט), 155–200 מינוט: 100% EtOH) מיט אַ פֿלוס ראַטע פֿון 1.5 מל/מינוט, קומאַמאָנאַמיד (1, 36.0 מג) איז געוואָרן אפגעזונדערט ווי אַ ווײַסער אַמאָרפֿישער פּודער.
קומאַמאָטאָאַמיד(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz, 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ אויסגערעכנטער ווערט: 141.0659, געמאסטענער ווערט: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
קאָלאָמביע זוימען (Col-0) זענען באַקומען געוואָרן פֿון דעם אַראַבידאָפּסיס ביאָלאָגישן רעסורס צענטער (ABRC) מיט דערלויבעניש פֿאַר פֿאָרשונג נוצן. Col-0 זוימען זענען פֿאַרמערט און געהאַלטן געוואָרן אונטער אונדזער לאַבאָראַטאָריע באַדינגונגען און געניצט ווי ווילד-טיפּ אַראַבידאָפּסיס געוויקסן. אַראַבידאָפּסיס זוימען זענען סטעריליזירט געוואָרן אויף דער ייבערפֿלאַך און קאָלטיווירט אין האַלב-שטאַרקייט מוראַשיגע און סקאָאָג מעדיום מיט 2% סוכראָז (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-מאָרפֿאָלינאָ)עטאַנסולפֿאָניק זויער (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical).) און 1.5% אַגאַר (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, ביי 23 °C און קאָנסטאַנט ליכט. זוימען פֿון דעם phs1-1 מוטאַנט זענען צוגעשטעלט געוואָרן דורך ט. האַשימאָטאָ (נאַראַ אינסטיטוט פֿון וויסנשאַפֿט און טעכנאָלאָגיע).
זוימען פון שטאַם SR-1 זענען צוגעשטעלט געוואָרן דורך ט. האַשימאָטאָ (נאַראַ אינסטיטוט פון וויסנשאַפֿט און טעכנאָלאָגיע) און געניצט ווי ווילד-טיפּ טאַבאַק פלאַנצן. טאַבאַק זוימען זענען ייבערפלאַך סטעריליזירט געוואָרן און איינגעווייקט אין סטעריל וואַסער פֿאַר דריי נעכט צו העכערן דזשערמאַניישאַן, דערנאָך געשטעלט אין אַ האַלב-שטאַרקייט לייזונג מיט 2% סוכראָז, 0.05% (w/v) MES, און 0.8% געלאַן גומע (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. און Skoog מעדיום) מיט pH 5.7 און אינקובירט ביי 23°C אונטער קאָנסטאַנט ליכט.
שטאַם טאַק-1 איז צוגעשטעלט געוואָרן דורך ט. קאָטשי (קיאָטאָ אוניווערסיטעט) און איז גענוצט געוואָרן ווי די סטאַנדאַרט עקספּערימענטאַלע איינהייט פֿאַר דער לעבערוואָרץ שטודיע. דזשעמאַ איז באַקומען געוואָרן פֿון סטעריליזירטע קולטורעלע פלאַנצן און דערנאָך געלייגט אויף גאַמבאָרג B5 מעדיום (Fujifilm Wako Pure Chemical) וואָס האָט ענטהאַלטן 1% סוכראָז און 0.3% געלאַן גומע און אינקובירט ביי 23°C אונטער קאָנטינויִערלעכן ליכט.
טאַבאַק BY-2 צעלן (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) זענען צוגעשטעלט געוואָרן דורך S. Hasezawa (אוניווערסיטעט פון טאָקיאָ). BY-2 צעלן זענען געוואָרן פארדיןנט 95-פאַך אין מאָדיפֿיצירטן לינסמייער און סקאָאָג מעדיום און סופּלעמענטירט וועכנטלעך מיט 2,4-דיכלאָראָפענאָקסיעטיק זויער 32. די צעל סאַספּענשאַן איז געמישט געוואָרן אויף אַ ראָטאַרי שעיקער ביי 130 רפּם ביי 27°C אין דער פינצטערניש. וואַשט צעלן מיט 10 מאָל דעם באַנד פון פרישן מעדיום און ריסאַספּענדירט אין דעם זעלבן מעדיום. BY-2 טראַנסגעניק צעל ליניעס וואָס סטאַביל אויסדריקן דעם מיקראָטובול מאַרקער TagRFP-TUA6 אָדער דעם אַקטין פֿילאַמענט מאַרקער GFP-ABD2 אונטער דעם בלומענקרויט מאָסאַיק ווירוס 35S פּראָמאָטער זענען גענערירט געוואָרן ווי באַשריבן 33,34,35. די צעל ליניעס קענען ווערן מיינטיינד און סינגקראַנייזירט ניצן פּראָצעדורן ענלעך צו די געניצט פֿאַר דער אָריגינעלער BY-2 צעל ליניע.
HeLa צעלן זענען קאָלטיווירט געוואָרן אין דולבעקאָס מאָדיפֿיצירטן איגלס מעדיום (DMEM) (לייף טעקנאַלאַדזשיז) סופּלעמענטירט מיט 10% פֿעטאַלן רינדער סערום, 1.2 U/ml פּעניסיללין, און 1.2 μg/ml סטרעפּטאָמיצין אין אַ 37°C אינקובאַטאָר מיט 5% CO2.
אַלע עקספּערימענטן באַשריבן אין דעם מאַנוסקריפּט זענען דורכגעפירט געוואָרן לויט יאַפּאַנישע ביאָסאַפעטי רעגולאַציעס און גיידליינז.
די קאַמפּאַונדז זענען אויפגעלייזט געוואָרן אין דימעטהיל סולפֿאָקסייד (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ווי לאַגער לייזונגען און פֿאַרדיןנט אין MS מעדיום פֿאַר אַראַבידאָפּסיס און טאַבאַק אָדער גאַמבאָרג B5 מעדיום פֿאַר לעבערוואָרץ. פֿאַר די וואָרצל וווּקס אינהיביציע פּרובירן, זענען מער ווי 10 זוימען פּער טעלער געזייט געוואָרן אויף אַגאַר מעדיום מיט די אנגעצייכנטע קאַמפּאַונדז אָדער DMSO. די זוימען זענען אינקובירט געוואָרן אין אַ וווּקס קאַמער פֿאַר 7 טעג. די זוימען זענען פאָטאָגראַפֿירט געוואָרן און די לענג פון די וואָרצלען איז געמאָסטן געוואָרן. פֿאַר אַראַבידאָפּסיס דזשערמאַניישאַן פּרובירן, זענען 48 זוימען פּער טעלער געזייט געוואָרן אויף אַגאַר מעדיום מיט 200 μM קאַמפּאַונד אָדער DMSO. אַראַבידאָפּסיס זוימען זענען געוואַקסן אין אַ וווּקס קאַמער און די נומער פון געדזשערמטע זוימען איז געציילט געוואָרן 7 טעג נאָך דזשערמאַניישאַן (טאָג). פֿאַר טאַבאַק דזשערמאַניישאַן פּרובירן, זענען 24 זוימען פּער טעלער געזייט געוואָרן אויף אַגאַר מעדיום מיט 200 μM KAND אָדער DMSO. טאַבאַק זוימען זענען געוואַקסן אין אַ וווּקס קאַמער און די נומער פון געדזשערמטע זוימען איז געציילט געוואָרן נאָך 14 טעג. פֿאַר דעם לעבערוואָרץ וואוקס אינהיביציע אַסיי, זענען 9 עמבריאָס פֿון יעדער פּלאַטע געלייגט געוואָרן אויף אַגאַר מעדיום מיט די אנגעגעבענע קאָנצענטראַציעס פֿון KAND אָדער DMSO און אינקובירט געוואָרן אין אַ וואוקס קאַמער פֿאַר 14 טעג.
ניצט יונגע געוויקסן געפארבט מיט 5 מג/מל פּראָפּידיום יאָדיד (PI) צו וויזואַליזירן וואָרצל מעריסטעם אָרגאַניזאַציע. PI סיגנאַלן זענען באמערקט געוואָרן דורך פלואָרעסענס מיקראָסקאָפּיע מיט אַ TCS SPE קאָנפאָקאַל לאַזער סקאַנינג מיקראָסקאָפּ (Leica Microsystems).
היסטאכעמישע פארבונג פון ווארצלען מיט β-גלוקוראנידאזע (GUS) איז דורכגעפירט געווארן לויטן פראטאקאל באשריבן דורך מאלאמי און בענפיי36. די זוימען זענען פיקסירט געווארן אין 90% אצעטאן איבערנאכט, געפארבט מיט 0.5 מג/מל 5-בראמא-4-כלארא-3-אינדאליל-β-ד-גלוקוראנישע זויער אין GUS באפער פאר 1 שעה און געשטעלט אין א כיידרירטע כלאראלדעהייד לייזונג (8 ג כלאראל כיידרייט, 2 מל וואסער און 1 מל גליסערין) און באמערקט דורך דיפערענציעלע אינטערפערענץ קאנטראסט מיקראסקאפיע ניצנדיג אן Axio Imager M1 מיקראסקאפע (Carl Zeiss).
וואָרצל ווינקלען זענען געמאָסטן געוואָרן אויף 7-טאָגיקע זוימען וואָס זענען געוואַקסן אויף ווערטיקאַל געשטעלטע פּלאַטעס. מעסט דעם ווינקל פון דער וואָרצל פֿון דער ריכטונג פֿון דעם גראַוויטאַציע וועקטאָר ווי באַשריבן אין שריט 6.
די אָרדענונג פון קאָרטיקאַלע מיקראָטובולעס איז באמערקט געוואָרן ווי באַשריבן, מיט קליינע מאָדיפיקאַציעס צום פּראָטאָקאָל 37. אַנטי-β-טובולין אַנטיבאָדי (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) און Alexa Fluor 488-קאָנדזשוגירט אַנטי-מויז IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) זענען גענוצט געוואָרן ווי ערשטיקע און צווייטיקע אַנטיבאָדיעס ביי 1:1000 און 1:100 דיילושאַנז, ריספּעקטיוולי. פלאָרעסענס בילדער זענען באַקומען מיט אַ TCS SPE קאָנפאָקאַל לאַזער סקאַנינג מיקראָסקאָפּ (Leica Microsystems). באַקומען Z-סטאַק בילדער און שאַפֿן מאַקסימום אינטענסיטעט פּראַדזשעקשאַנז לויט די פאַבריקאַנט ס אינסטרוקציעס.
HeLa צעל פּראָליפעראַציע אַסיי איז דורכגעפירט געוואָרן מיט צעל קאַונטינג קיט 8 (דאָדזשינדאָ) לויט די אינסטרוקציעס פונעם פאַבריקאַנט.
דער וואוקס פון E. coli DH5α איז אנאליזירט געווארן דורך מעסטן צעל געדיכטקייט אין קולטור מיט א ספּעקטראָפאָטאָמעטער ביי 600 נם (OD600).
ציטאָסקעלעטאַל אָרגאַניזאַציע אין טראַנסגעניק BY-2 צעלן איז געווען באמערקט מיט אַ פלואָרעסענס מיקראָסקאָפּ אויסגעשטאַט מיט אַ CSU-X1 קאָנפאָקאַל סקאַנינג מיטל (Yokogawa) און אַן sCMOS קאַמעראַ (Zyla, Andor Technology). ציטאָסקעלעטאַל געדיכטקייט איז געווען אַססעססעד דורך בילד אַנאַליסיס, וואָס קוואַנטיפיצירט די פּראָצענט פון ציטאָסקעלעטאַל פּיקסעלס צווישן ציטאָפּלאַזמיק פּיקסעלס אין קאָנפאָקאַל בילדער מיט ImageJ ווייכווארג ווי באַשריבן38,39.
כדי צו דעטעקטירן צעל טויט אין BY-2 צעלן, איז אן אליקוואט פון דער צעל סוספענשאן אינקובירט געווארן מיט 0.05% עוואנס בלוי פאר 10 מינוט ביי צימער טעמפעראטור. סעלעקטיווע עוואנס בלוי פארבונג פון טויטע צעלן איז אפהענגיק פון אויסשטויסן דעם פארב פון לעבנס-פעאיגע צעלן דורך דער גאנצער פלאזמע מעמבראן40. געפארבטע צעלן זענען באמערקט געווארן מיט א ברייט-פעלד מיקראסקאפ (BX53, אולימפוס).
HeLa צעלן זענען געוואקסן אין DMEM סופּלעמענטירט מיט 10% FBS אין אַ פייַכטיק אינקובאַטאָר ביי 37°C און 5% CO2. צעלן זענען באהאנדלט געוואָרן מיט 100 μM KAND 11, קומאַמאָנאַמיק זויער 6, קומאַמאָנאַמיד 1, 100 ng/ml קאָלסמיד (Gibco), אָדער 100 ng/ml נאָקאָדמייז (Sigma) פֿאַר 6 שעה ביי 37°C. צעלן זענען פיקסירט געוואָרן מיט MetOH פֿאַר 10 מינוט און דערנאָך מיט אַצעטאַט פֿאַר 5 מינוט ביי צימער טעמפּעראַטור. פיקסירטע צעלן זענען אינקובירט געוואָרן מיט β-טובולין ערשטיק אַנטיבאָדי (1D4A4, Proteintech: 66240-1) פארדיןנט אין 0.5% BSA/PBS פֿאַר 2 שעה, געוואַשן 3 מאָל מיט TBST, און דערנאָך אינקובירט מיט Alexa Fluor ציג אַנטיבאָדי. 488 1 שעה. – מויז IgG (טהערמאָ פישער סייענטיפיק: A11001) און 15 ng/ml 4′,6-דיאַמידינאָ-2-פענילינדאָל (DAPI) פארדיןנט אין 0.5% BSA/PBS. נאך וואַשן מיט TBST דריי מאָל, זענען געפאַרבטע צעלן באמערקט געוואָרן אויף אַ ניקאָן עקליפּס Ti-E ינווערטעד מיקראָסקאָפּ. בילדער זענען קאַפּטשערד מיט אַ קילע האַמאַמאַטסו ORCA-R2 CCD קאַמעראַ ניצנדיק MetaMorph ווייכווארג (מאָלעקולאַר דעווייסעס).